蛇龍珠葡萄（煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)）自然發(fā)酵醪中選育的釀酒酵母發(fā)酵特性研究

韓鵬，程仕偉，，姜文廣，趙慧，侯小芳，徐巖，李記明*

（1.煙臺(tái)張?jiān)＜瘓F(tuán)有限公司山東省葡萄酒微生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái)265709；2.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264025；3.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

蛇龍珠葡萄（煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)）自然發(fā)酵醪中選育的釀酒酵母發(fā)酵特性研究

韓鵬1，程仕偉1，2，姜文廣1，趙慧2，侯小芳2，徐巖3，李記明1*

（1.煙臺(tái)張?jiān)＜瘓F(tuán)有限公司山東省葡萄酒微生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái)265709；2.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264025；3.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

對(duì)煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)蛇龍珠葡萄自然發(fā)酵醪中篩選的12株釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵特性研究。首先對(duì)發(fā)酵終止后的殘?zhí)橇亢途凭w積分?jǐn)?shù)測(cè)定，再對(duì)部分菌株進(jìn)行耐酒精、耐酸、耐SO2和耐高糖能力測(cè)定，選取3株發(fā)酵性狀較好的釀酒酵母用于蛇龍珠干紅葡萄酒釀制。結(jié)果菌株YSF4的發(fā)酵特性良好，發(fā)酵后酒樣指標(biāo)較好，甚至優(yōu)于商品化酵母，具備工業(yè)葡萄酒釀造應(yīng)用潛力。

蛇龍珠；自然發(fā)酵；釀酒酵母；發(fā)酵特性

蛇龍珠（Cabernet Gernischt）為解百納干紅釀造的主要原料之一，是我國(guó)特有的葡萄酒原料品種，也是我國(guó)第二大釀酒葡萄栽培品種（僅次于赤霞珠），已有超過(guò)110年的種植歷史[1-2]。蛇龍珠最初只在中國(guó)煙臺(tái)大規(guī)模種植，直至20世紀(jì)80年代末期才在全國(guó)范圍內(nèi)推廣種植，目前煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)的蛇龍珠釀酒葡萄栽培面積已接近6 667 hm2，約占全國(guó)的70%[3]。

微生物尤其是釀酒酵母是葡萄酒品質(zhì)的決定性因素，采用不同釀酒酵母和相同葡萄原料發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒，在色澤、香氣、感官質(zhì)量以及出酒率等方面都存在較大的差異[4-7]。目前我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)的一個(gè)突出問(wèn)題是大量使用商品化活性干酵母導(dǎo)致葡萄酒品質(zhì)同質(zhì)化嚴(yán)重，擁有核心競(jìng)爭(zhēng)力和地域特色的高品質(zhì)葡萄酒品種偏少[8-11]。鑒于蛇龍珠葡萄是我國(guó)特有品種且在煙臺(tái)產(chǎn)地種植多年，其中必定蘊(yùn)藏著豐富的本土釀酒資源。因此本研究的目的是通過(guò)多布點(diǎn)取樣并自然發(fā)酵，篩選能夠適應(yīng)蛇龍珠葡萄酒釀造的高品質(zhì)本土釀酒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀造干紅的蛇龍珠原料：蓬萊大柳行葡萄種植基地；商品酵母D254和RC212：法國(guó)Laffort公司；酵母粉和蛋白胨：OXOID公司；其余試劑均為分析純或生物純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；SWCJ-1B超凈工作臺(tái)：蘇州安泰；H1850R離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器；WineScanTM葡萄酒分析儀：丹麥FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母的篩選

蛇龍珠釀酒葡萄破碎除梗后自然發(fā)酵3 d后，涂布孟加拉紅培養(yǎng)基（葡萄糖10g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.5g/L，蛋白胨5g/L，孟加拉紅0.0133g/L，氯霉素0.1g/L，瓊脂20g/L，pH 6.5）。平板至長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落轉(zhuǎn)接WL培養(yǎng)基平板（酵母粉4g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖50g/L，KH2PO40.55g/L，KCl 0.425 g/L，CaCl20.125 g/L，MgSO40.125 g/L，F(xiàn)eCl30.002 5 g/L，MnSO40.002 5 g/L，溴甲酚綠0.022 g/L，瓊脂20 g/L，pH 5.5），培養(yǎng)5 d后觀察菌落形態(tài)。

1.3.2 還原糖與酒精度測(cè)定

篩選的釀酒酵母首先經(jīng)活化培養(yǎng)基（葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 6.5）活化20 h，接種環(huán)蘸取菌種入10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖220 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 6.5）試管中，以商品化酵母D254為對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵6 d后測(cè)定還原糖和酒精度。采用DNS比色法測(cè)定還原糖的含量，重鉻酸鉀比色法測(cè)定酒精度[12]。

1.3.3 釀酒酵母耐受力測(cè)定

采用不同酒精體積分?jǐn)?shù)（10%、13%、16%、19%）、檸檬酸質(zhì)量濃度（5 g/L、8 g/L、11 g/L、14 g/L）、SO2質(zhì)量濃度（60 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L）和葡糖糖質(zhì)量濃度（200 g/L、300 g/L、400 g/L、500 g/L）的10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基（內(nèi)裝有杜氏管），接種已活化的菌液一環(huán)，以商品化酵母D254為對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)48 h，依據(jù)杜氏管充滿CO2氣體時(shí)間來(lái)判定釀酒酵母的耐受力。

1.3.4 發(fā)酵生產(chǎn)干紅葡萄酒

菌種經(jīng)活化培養(yǎng)基（葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 6.5）活化20 h后，在8℃、10 000 r/min條件下離心收集菌體，加無(wú)菌水混旋后離心洗滌2次，收集菌體備用。

成熟期的蛇龍珠釀酒葡萄經(jīng)除梗破碎機(jī)粉碎，裝入20 L發(fā)酵瓶，裝液量15 L，按照10%的接種量接入釀酒酵母（活化培養(yǎng)基體積計(jì)），混勻后室溫條件下發(fā)酵，定期稱質(zhì)量。發(fā)酵5 d后進(jìn)入終止期，酒樣經(jīng)5 000 r/min離心后利用葡萄酒分析儀測(cè)定酒精體積分?jǐn)?shù)、總酸、揮發(fā)酸、殘?zhí)牵壬y(cè)定單寧、色度、花色苷和總酚[13-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母篩選

自張?jiān)９九钊R、龍口和萊州種植基地分別采摘成熟期蛇龍珠釀酒葡萄，除梗破碎后分別裝入事先滅菌的1 L發(fā)酵瓶進(jìn)行自然發(fā)酵，發(fā)酵3 d后取酒樣稀釋涂布孟加拉紅培養(yǎng)基平板，在28℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，挑取酵母菌單菌落轉(zhuǎn)接WL顯色培養(yǎng)基，在28℃培養(yǎng)5 d。最終獲得具有明顯釀酒酵母特征的菌株12株，其在顯色培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)為奶油色且稍帶綠色、球形凸出、表面光滑、不透明，菌落形態(tài)見(jiàn)圖1（以菌株YSF8為例）。WL培養(yǎng)基對(duì)釀酒酵母的鑒別準(zhǔn)確度可達(dá)100%[16]，結(jié)果可信度高，故篩選的菌株為釀酒酵母。

圖1 釀酒酵母YCF8在WL培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)Fig.1 Growth morphology ofS.scerevisiaeYCF8 in WL medium

2.2 產(chǎn)酒精能力與殘?zhí)橇糠治?/p>

以商品化釀酒酵母D254作為對(duì)照，在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵6 d后的發(fā)酵液中殘?zhí)橇亢途凭w積分?jǐn)?shù)見(jiàn)表1。菌株YSF1、YSF2、YSF3、YSF4、YSF6、YSF8和YSF9的發(fā)酵后殘?zhí)桥c酒精體積分?jǐn)?shù)與D254的發(fā)酵后數(shù)據(jù)差異不大，故作為后續(xù)深入研究的酵母菌株，而菌株YSF5、YSF7、YSF10、YSF11和YSF12的發(fā)酵液中殘?zhí)橇烤^(guò)10g/L，酒精體積分?jǐn)?shù)也相對(duì)較低?？傮w來(lái)看，發(fā)酵6d后的殘?zhí)橇课催_(dá)到干酒的標(biāo)準(zhǔn)（≤4 g/L），原因可能是發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源較豐富，與葡萄原料成分差異較大所致。

表1 發(fā)酵液中殘?zhí)呛途凭w積分?jǐn)?shù)Table 1 Residual sugar and alcohol content in the broth

2.3 耐受酒精能力

釀酒酵母耐受酒精能力的結(jié)果見(jiàn)圖2。工業(yè)化葡萄酒釀造過(guò)程中酒精體積分?jǐn)?shù)一般為12%[17]，在10%、13%、16%和19%酒精體積分?jǐn)?shù)條件下，供試酵母均有較好的酒精耐受力，能夠滿足發(fā)酵要求。其中YSF2、YSF4和YSF8在不同酒精體積分?jǐn)?shù)下的耐受能力與商品酵母D254相當(dāng)，具備應(yīng)用潛力，而菌株YSF1、YSF3、YSF6和YSF9的耐受力尤其是耐受高體積分?jǐn)?shù)酒精能力略差。

圖2 釀酒酵母耐受酒精能力Fig.2 Alcohol tolerance ofS.cerevisiae

2.4 耐受SO2能力

釀酒酵母耐受SO2能力的結(jié)果見(jiàn)圖3。葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中SO2在葡萄汁中添加量為一般為60～100 mg/L[18]，由圖3可以看出，選育的釀酒酵母在60 mg/L、100 mg/L、150 mg/L和200 mg/L的SO2質(zhì)量濃度條件下均能夠快速起酵，滿足葡萄酒釀造要求，其中YSF1、YSF2和YSF8的起酵速率優(yōu)于商品化酵母。

圖3 釀酒酵母耐受SO2能力Fig.3 SO2tolerance ofS.cerevisiae

2.5 耐酸能力

圖4 釀酒酵母耐酸能力Fig.4 Acid tolerance ofS.cerevisiae

釀酒酵母的耐酸能力見(jiàn)圖4。由圖4可知，在檸檬酸質(zhì)量濃度為5 g/L、8 g/L、11 g/L、14 g/L時(shí)，所用釀酒酵母均能夠正常發(fā)酵，滿足實(shí)際葡萄酒釀造要求。菌株YSF2、 YSF3、YSF4和YSF8的耐酸能力與商品酵母D254大致相當(dāng)，而菌株YSF1、YSF6和YSF9對(duì)高質(zhì)量濃度的有機(jī)酸的耐受力要低于D254。

2.6 耐高糖能力

供試菌株耐受高糖能力見(jiàn)圖5。由圖5可知，酵母菌YSF2、YSF3、YSF4和YSF8的耐受力與商品酵母D254無(wú)差異，而菌株YSF1、YSF6和YSF9對(duì)高質(zhì)量濃度葡萄糖的耐受力要低于商品酵母D254。

圖5 釀酒酵母耐高糖能力Fig.5 High glucose tolerance ofS.cerevisiae

2.7 釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)干紅葡萄酒

選取具有應(yīng)用潛力的菌株YSF2、YSF4和YSF8進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)干紅葡萄酒試驗(yàn)，以葡萄酒釀造生產(chǎn)中常用的商品酵母D254和RC212作為對(duì)照，發(fā)酵5d后測(cè)定各發(fā)酵參數(shù)指標(biāo)，結(jié)果如表2所示。就酒精體積分?jǐn)?shù)和總酸兩個(gè)指標(biāo)而言，選育的3株酵母菌與商品化酵母無(wú)明顯差異，菌株YSF8的發(fā)酵酒樣中揮發(fā)酸含量較高，并且其殘?zhí)菫?.21 g/L，超過(guò)干紅葡萄酒4 g/L的標(biāo)準(zhǔn)。菌株YSF4的發(fā)酵酒樣中單寧和總酚含量是最高的，達(dá)到1 423.58 mg/L和1 140.44 mg/L，并且其花色苷含量和色度除略低于D254外，高于其余釀酒酵母的發(fā)酵酒樣。經(jīng)品嘗，菌株YSF4的發(fā)酵酒樣香氣濃郁，有別于商品酵母的發(fā)酵酒樣。綜合以上研究結(jié)果，菌株YSF4具備工業(yè)化葡萄酒釀造潛力。

表2 發(fā)酵參數(shù)指標(biāo)Table 2 Fermentation parameters of wine

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先經(jīng)酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)后的殘?zhí)橇颗c酒精體積分?jǐn)?shù)測(cè)定，篩選到7株發(fā)酵性狀良好的釀酒酵母。在對(duì)供試菌株的耐受酒精、耐SO2、耐酸和耐高糖能力的結(jié)果進(jìn)行比較研究基礎(chǔ)上，篩選菌株YSF2、YSF4和YSF8用于發(fā)酵生產(chǎn)干紅葡萄酒，結(jié)果表明，YSF4菌株的發(fā)酵酒樣質(zhì)量較好，部分指標(biāo)優(yōu)于商品化酵母，具備工業(yè)葡萄酒釀造應(yīng)用潛力，后續(xù)香氣成分指標(biāo)分析研究工作正在進(jìn)行中。

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Fermentation characteristics ofSaccharomyce scerevisiaescreened by spontaneous fermentation with Cabernet Gernischt grapes(Yantai region)

HAN Peng1,CHENG Shiwei1,2,JIANG Wenguang1,ZHAO Hui2,HOU Xiaofang2,XU Yan3,LI Jiming1*
(1.Key Laboratory of Fermentation about Wine Microorganisms in Shandong Province,Changyu Group Company Co.,Ltd., Yantai 265709,China;2.School of Life Sciences,Ludong University,Yantai 264025,China; 3.Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The fermentation characteristics of 12 strains ofSaccharomyce scerevisiaescreened by spontaneous fermentation with Cabernet Gernischt grapes(Yantai region)were studied.Firstly,residual sugar content and alcohol content were determined after fermentation termination,and then the tolerance of alcohol,acid,SO2,and high glucose concentration were determined.At last,three strains that have better fermentation characters were used to produce dry red wine of Cabernet Gernischt.The results indicated that the strain YSF4 had good fermentation characteristics,and the wine samples had good index after fermentation,even superior to the commercialization yeast,which was suitable for industrial wine brewing industry.

Cabernet Gernischt;spontaneous fermentation;Saccharomyce scerevisiae;fermentation characteristics

TS201.3；Q938.2

A

0254-5071（2014）11-0037-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.008

2014-08-25

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目“863計(jì)劃”（2013AA102108-3）

韓鵬（1984-），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槠咸丫漆勗臁?/p>

*通訊作者：李記明（1966-），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槠咸丫漆勗臁?/p>