內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠血清TNF—α與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系

孫偉+王小平+金文揚(yáng)

[摘要] 目的 研究內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠血清TNF-α與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系及EPO對(duì)其的影響。 方法 將180只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、脂多糖LPS組及EPO處理組，分別在處理后2h、 4h、 6h、 12h、 24h斷頭取血并取其心臟。采用ELISA法測定血清TNF-α，用TUNEL法檢測原位凋亡。 結(jié)果 ①LPS組TNF-α濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯高于對(duì)照組（P<0.05），隨后TNF-α濃度開始下降，并在6h時(shí)降到正常，與對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。LPS+EPO組TNF-α濃度在2 h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），隨后開始下降，在6h時(shí)降到正常值；②LPS組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯高于對(duì)照組（P<0.05），隨后開始下降，并在4h、6h、12h、24h時(shí)均明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。LPS+EPO組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），隨后開始下降，并在4 h、6 h、12 h、24 h時(shí)均明顯低于LPS組（P<0.05）；③心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與血清TNF-α存在明顯的直線正相關(guān)性。結(jié)論 血清TNF-α參與了內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠的心肌損傷的病理過程，與心肌細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)性，EPO通過抑制TNF-α的產(chǎn)生而延緩心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠的心肌具有保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 內(nèi)毒素血癥；TNF-α；心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)；EPO

[中圖分類號(hào)] R541 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）02-0001-03

A study on the relationship between endotoxemia serum TNF-α of Wistar rats and apoptosis of myocardial cell

SUN Wei WANG Xiaoping JIN Wenyang

Emergency Department， Taizhou Hospital， Enze Medical Center of Taizhou in Zhejiang province，Taizhou 317000，China

[Abstract] Objective To study the relationship of rat serum TNF-α of endotoxin blood disease and the apoptosis of myocardial cells and EPOs effects on it. Methods 180 Wistar rats were randomly divided into the control group， lipopolysaccharide LPS group and EPO treatment group. All the rats were respectively beheaded 2h， 4h， 6h， 12h and 24h after treatment for their blood samples and their levers were also taken out. Their TNF-α were tested by way of ELISA， and their in situ apoptosis were tested through the method of TUNEL. Results ①The TNF-α concentration of the LPS group reached its highest level in 2 hours， and it was obviously higher than that of the control group（P<0.05）， then the concentration began to decrease， and resumed its normal level in 6 hours. It was statistically insignificant（P>0.05）. The TNF-α concentration of LPS+EPO group reached its peak in 2 hours， and it was obviously lower than that of the LPS group （P<0.05）， then it began to decrease， and became normal in 6 hours； ②The apoptosis index of myocardial cells of the LPS group reached its peak in 2 hours， and it was obviously higher than that of the control group （P<0.05）， then it began to decrease， it was respectively and obviously higher than that of the control group in 4h， 6h， 12h and 24h （P<0.05）. The apoptosis index of myocardial cells of the LPS+EPO group reached its peak in 2 hours， and it was obviously lower than that of the control group （P<0.05）， then it began to decrease， and was respectively and obviously lower than that of the LPS group in 4h， 6h， 12h and 24h （P<0.05）； ③ The myocardial apoptosis index had an obviously positive linear correlation with TNF-α. Conclusion The serum TNF-α is involved in the myocardial pathological injury process of Wistar rats with endotoxin blood disease， it has a positive correlation with myocardial cell apoptosis. EPO can prolong the process of myocardial cell apoptosis by inhibiting the production of TNF-α， it is myocardially protective for Wistar rats with endotoxin blood disease.

[Key words] Dndotoxin blood disease； TNF-α； Apoptosis index of myocardial cells； EPO

近年來研究證實(shí)，機(jī)體在遭遇感染時(shí)首先產(chǎn)生的、起核心作用的炎癥介質(zhì)是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF），尤其是TNF-α。脂多糖（LPS）是引起感染性休克機(jī)體損傷的主要物質(zhì)，可對(duì)機(jī)體形成廣泛的影響及損傷，并引起心率減慢、心肌收縮力下降，嚴(yán)重影響心功能[1]。已有研究表明[2]，EPO對(duì)心臟有保護(hù)作用。目前TNF-α與內(nèi)毒素血癥心肌細(xì)胞凋亡之間關(guān)系未見系統(tǒng)報(bào)道，外源性EPO對(duì)心肌的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。本研究于2011年9月到2012年12月通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，采用ELISA法測定血清TNF-α，用TUNEL法檢測原位凋亡，探討血清TNF-α與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系及EPO對(duì)其的影響，為促紅細(xì)胞生成素在膿毒癥患者中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

180只健康Wistar大鼠，不分雌雄，體重為（20±2）g，購買于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為：SCXK（鄂）2004-0007。

EPO（產(chǎn)品序號(hào)CSB-E04539m）以及ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司，脂多糖LPS購于SIGMA公司，產(chǎn)品序號(hào)L2880。用于TUNEL法檢測原位凋亡的In situ cell death detection試劑盒購于德國Boehringer-Mannheim公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將180只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、脂多糖LPS組及EPO處理組，每組60只，每小組分成2h、 4h、 6h、 12h、 24h五個(gè)亞組，每個(gè)亞組12只。脂多糖LPS組給予腹腔注射LPS 0.5mg/kg，對(duì)照組大鼠給予腹腔注射等量生理鹽水，EPO組大鼠給予腹腔注射LPS 0.5mg/kg及EPO 4000U/kg。各亞組大鼠在所對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)斷頭取血0.5mL，離心保存在-20℃冰箱等待檢測。并即刻解剖取其心臟保存在-20℃冰箱。采用ELISA法測定血清TNF-α，用TUNEL法檢測原位凋亡。

1.3 研究指標(biāo)及測定方法

血清TNF-α濃度的測定：采用雙抗體夾心ELISA法。TNF-α的濃度單位以pg/mL表示，試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司。嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行試驗(yàn)操作，顯色以后從全自動(dòng)酶標(biāo)儀上直接讀數(shù)得到TNF-α濃度值。

心肌細(xì)胞凋亡的測定：選用大鼠的左心室心肌行石蠟切片，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。每只大鼠觀察10張切片，每張切片在光鏡下（×400）隨機(jī)選10個(gè)視野，圖像分析用MICRO-COS-MOS MiVnt圖片分析系統(tǒng)，得到陽性細(xì)胞百分率及陽性細(xì)胞胞漿胞核的平均光密度值（MOD），算出細(xì)胞凋亡指數(shù)AI（AI%=MOD×陽性細(xì)胞百分率×100）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，TNF-α濃度及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均為定量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，運(yùn)用方差分析；相關(guān)分析采用簡單相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠血清TNF-α變化

LPS組TNF-α的濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯高于生理鹽水對(duì)照組（P<0.05），隨后TNF-α濃度開始下降，并在6h時(shí)降到正常，與生理鹽水對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。LPS+EPO組TNF-α濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），隨后開始下降，在6h時(shí)降到正常值。內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠血清TNF-α變化詳細(xì)情況見表1。

2.2 內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)變化

LPS組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯高于生理鹽水對(duì)照組（P<0.05），隨后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)開始下降，并在4h，6h，12h，24h時(shí)均明顯高于生理鹽水對(duì)照組（P<0.05）。LPS+EPO組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），隨后開始下降，并在4h、6h、12h、24h時(shí)均明顯低于LPS組（P<0.05）。內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)變化詳細(xì)情況見表2。

2.3 內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與血清TNF-α之間的相關(guān)性

經(jīng)過簡單相關(guān)分析表明，內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與血清TNF-α存在明顯的直線正相關(guān)性（r=0.7643，P<0.05，Y=457.58X-109.63）。

3 討論

膿毒血癥是臨床上較多見的危重病，通常引起多器官功能的衰竭而導(dǎo)致患者死亡。膿毒血癥是學(xué)界公認(rèn)的導(dǎo)致重癥病人死亡的首要因素，特別是膿毒癥休克（sepsis shock）患者的死亡率達(dá)到46.5%。膿毒血癥的發(fā)生常常是由于細(xì)菌分泌的內(nèi)毒素釋放進(jìn)入血液。內(nèi)毒素可使機(jī)體產(chǎn)生全身炎癥反應(yīng)綜合癥進(jìn)而損傷多器官臟器，尤其是導(dǎo)致血液循環(huán)紊亂及心功能衰竭。膿毒癥的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，涉及炎癥、感染、組織損傷及免疫等諸多方面，并關(guān)系到多器官病理生理的改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)毒素誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于生理鹽水對(duì)照組（P<0.05），表明膿毒癥可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。內(nèi)毒素誘導(dǎo)的膿毒癥導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)理雖然還不十分清楚，但心肌細(xì)胞凋亡后心肌收縮力下降，會(huì)加速內(nèi)毒素對(duì)心肌的損傷進(jìn)程[3，4]。

機(jī)體受到LPS刺激后，巨噬細(xì)胞會(huì)明顯上調(diào)TNFmRNA的表達(dá)，進(jìn)而合成分泌TNF-α增加，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而損傷心臟功能，與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。TNF-α是活化T淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌的免疫調(diào)節(jié)因子，其生物學(xué)活性十分廣泛。正常人血清中的TNF-α濃度較低，感染性休克或膿毒癥患者血清TNF-α濃度明顯增加[5，6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS組TNF-α濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯高于對(duì)照組（P<0.05），表明血清TNF-α參與了內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠的心肌損傷的病理過程，與心肌細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)性。

EPO是人工克隆的生長因子，通常用于治療貧血以促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，在臨床上得到廣泛應(yīng)用已久。EPO造血活性的主要機(jī)理不是直接刺激紅細(xì)胞的產(chǎn)生，而是抑制晚紅系祖細(xì)胞的凋亡[7]?？梢奅PO有延緩細(xì)胞凋亡的功能，其抑制細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制目前尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)肝臟、腦、子宮等器官及腫瘤組織中有EPO受體的存在，EPO的其他臨床功能逐漸得到重視[8]。近些年來對(duì)EPO的腦保護(hù)作用研究較多，EPO及其受體通過抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用，可減輕神經(jīng)組織缺血再灌注損傷。有報(bào)道指出EPO可明顯延緩缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡，此外在器官水平的實(shí)驗(yàn)表明EPO可減少缺血再灌注心肌梗死及損傷心肌的范圍，進(jìn)而提高心功能[9，10]。本研究結(jié)果顯示，LPS+EPO組TNF-α濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），隨后開始下降，在6h時(shí)降到正常值，LPS+EPO組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），表明EPO通過抑制TNF-α的產(chǎn)生而延緩心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠的心肌具有保護(hù)作用。

本組研究結(jié)果顯示，內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與血清TNF-α存在明顯的直線正相關(guān)性（r=0.7643，P<0.05，Y=457.58X-109.63），表明TNF-α是參與內(nèi)毒素血癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要因素。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，LPS+EPO組TNF-α濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），隨后開始下降，在6h時(shí)降到正常值，表明外源性EPO可抑制TNF-α的產(chǎn)生。給予膿毒血癥大鼠外源性EPO可降低血清TNF-α的水平，從而降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，延緩心肌細(xì)胞凋亡，改善大鼠心肌收縮力及心功能，降低大鼠病死率。

總之，血清TNF-α參與了內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠的心肌損傷的病理過程，與心肌細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)性，EPO通過抑制TNF-α的產(chǎn)生而延緩心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠的心肌具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果為EPO治療膿毒癥患者心肌損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[3] 徐良，周凱. EPO對(duì)失血性休克合并內(nèi)毒素血癥兔TNF-α、IL-6、IL-10、MDA影響的研究[J]. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，34（2）：155-157.

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[10] 閆士蓮，許國星，鐘傳茂，等. 腫瘤壞死因子-α與糖尿病心肌病關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2007，45（12）：20-23.

（收稿日期：2013-08-14）

EPO是人工克隆的生長因子，通常用于治療貧血以促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，在臨床上得到廣泛應(yīng)用已久。EPO造血活性的主要機(jī)理不是直接刺激紅細(xì)胞的產(chǎn)生，而是抑制晚紅系祖細(xì)胞的凋亡[7]。可見EPO有延緩細(xì)胞凋亡的功能，其抑制細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制目前尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)肝臟、腦、子宮等器官及腫瘤組織中有EPO受體的存在，EPO的其他臨床功能逐漸得到重視[8]。近些年來對(duì)EPO的腦保護(hù)作用研究較多，EPO及其受體通過抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用，可減輕神經(jīng)組織缺血再灌注損傷。有報(bào)道指出EPO可明顯延緩缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡，此外在器官水平的實(shí)驗(yàn)表明EPO可減少缺血再灌注心肌梗死及損傷心肌的范圍，進(jìn)而提高心功能[9，10]。本研究結(jié)果顯示，LPS+EPO組TNF-α濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），隨后開始下降，在6h時(shí)降到正常值，LPS+EPO組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），表明EPO通過抑制TNF-α的產(chǎn)生而延緩心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠的心肌具有保護(hù)作用。

本組研究結(jié)果顯示，內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與血清TNF-α存在明顯的直線正相關(guān)性（r=0.7643，P<0.05，Y=457.58X-109.63），表明TNF-α是參與內(nèi)毒素血癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要因素。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，LPS+EPO組TNF-α濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），隨后開始下降，在6h時(shí)降到正常值，表明外源性EPO可抑制TNF-α的產(chǎn)生。給予膿毒血癥大鼠外源性EPO可降低血清TNF-α的水平，從而降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，延緩心肌細(xì)胞凋亡，改善大鼠心肌收縮力及心功能，降低大鼠病死率。

總之，血清TNF-α參與了內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠的心肌損傷的病理過程，與心肌細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)性，EPO通過抑制TNF-α的產(chǎn)生而延緩心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠的心肌具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果為EPO治療膿毒癥患者心肌損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[10] 閆士蓮，許國星，鐘傳茂，等. 腫瘤壞死因子-α與糖尿病心肌病關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2007，45（12）：20-23.

（收稿日期：2013-08-14）

EPO是人工克隆的生長因子，通常用于治療貧血以促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，在臨床上得到廣泛應(yīng)用已久。EPO造血活性的主要機(jī)理不是直接刺激紅細(xì)胞的產(chǎn)生，而是抑制晚紅系祖細(xì)胞的凋亡[7]?？梢奅PO有延緩細(xì)胞凋亡的功能，其抑制細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制目前尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)肝臟、腦、子宮等器官及腫瘤組織中有EPO受體的存在，EPO的其他臨床功能逐漸得到重視[8]。近些年來對(duì)EPO的腦保護(hù)作用研究較多，EPO及其受體通過抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用，可減輕神經(jīng)組織缺血再灌注損傷。有報(bào)道指出EPO可明顯延緩缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡，此外在器官水平的實(shí)驗(yàn)表明EPO可減少缺血再灌注心肌梗死及損傷心肌的范圍，進(jìn)而提高心功能[9，10]。本研究結(jié)果顯示，LPS+EPO組TNF-α濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），隨后開始下降，在6h時(shí)降到正常值，LPS+EPO組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），表明EPO通過抑制TNF-α的產(chǎn)生而延緩心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠的心肌具有保護(hù)作用。

本組研究結(jié)果顯示，內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與血清TNF-α存在明顯的直線正相關(guān)性（r=0.7643，P<0.05，Y=457.58X-109.63），表明TNF-α是參與內(nèi)毒素血癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要因素。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，LPS+EPO組TNF-α濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值，且明顯低于LPS組（P<0.05），隨后開始下降，在6h時(shí)降到正常值，表明外源性EPO可抑制TNF-α的產(chǎn)生。給予膿毒血癥大鼠外源性EPO可降低血清TNF-α的水平，從而降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，延緩心肌細(xì)胞凋亡，改善大鼠心肌收縮力及心功能，降低大鼠病死率。

總之，血清TNF-α參與了內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠的心肌損傷的病理過程，與心肌細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)性，EPO通過抑制TNF-α的產(chǎn)生而延緩心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠的心肌具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果為EPO治療膿毒癥患者心肌損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2013-08-14）