4種分離培養(yǎng)基檢測志賀氏菌效果比較

王建昌，陳志敏，李靜，王金鳳，姜彥芬，孫曉霞

（河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，河北石家莊050051）

4種分離培養(yǎng)基檢測志賀氏菌效果比較

王建昌，陳志敏，李靜，王金鳳，姜彥芬，孫曉霞

（河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，河北石家莊050051）

志賀氏菌是一類具有高度傳染性的腸道致病菌。文中基于GB 4789.5—2012《志賀氏菌檢驗》標(biāo)準(zhǔn)，比較了4種分離培養(yǎng)基檢測志賀氏菌的效果。通過4種分離培養(yǎng)基對福氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌的回收率、最低檢出限及對不同樣品檢測效果的比較，對不同培養(yǎng)基的檢測效果進行評價。結(jié)果顯示4種分離培養(yǎng)基最低檢出限相近，顯色培養(yǎng)基01檢測特異性優(yōu)于其他3種；針對實際檢測樣品，應(yīng)靈活選擇培養(yǎng)條件，以提高檢測的準(zhǔn)確性及效率。

福氏志賀氏菌；宋內(nèi)氏志賀氏菌；顯色培養(yǎng)基；檢測效果比較

志賀氏菌屬是一類革蘭氏陰性桿菌，是人類細菌性痢疾最為常見的病原菌[1]，通稱痢疾桿菌，為兼性厭氧菌[2]，按照抗原結(jié)構(gòu)和生化反應(yīng)的不同分為痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、鮑氏志賀氏菌（Shigella boydii）和宋內(nèi)氏志賀氏菌（Shigella sonnei）。在發(fā)達國家志賀氏菌感染主要為宋內(nèi)氏志賀氏菌，而在我國流行菌株則以福氏志賀氏菌為主[3-6]。志賀氏菌引起痢疾的傳染源主要為病人和帶菌者，主要是通過污染了志賀氏菌的食物、飲水等經(jīng)口感染，具有十分重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[7]。人類對志賀氏菌感染度極高。在食物衛(wèi)生檢驗時，志賀氏菌常作為必檢指標(biāo)之一，因此及時準(zhǔn)確的檢測手段是預(yù)防和控制志賀氏菌傳播的關(guān)鍵。

目前食品中志賀氏菌的檢測方法主要有常規(guī)生化鑒定方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法[8-17]，但無論使用何種方法，從檢測樣品中準(zhǔn)確分離到目標(biāo)菌是確證的關(guān)鍵。鑒于志賀氏菌在進出口食品檢測、國內(nèi)食品日常監(jiān)測中的重要性，國家衛(wèi)計委志賀氏菌最新版檢測標(biāo)準(zhǔn)由推薦性改為強制性國標(biāo)GB 4789.5—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗志賀氏菌檢驗》，且在分離培養(yǎng)時增加了顯色培養(yǎng)基。顯色培養(yǎng)基是一種新型的微生物檢測手段，培養(yǎng)基中加入檢測目標(biāo)菌的特征性酶的顯色底物，當(dāng)目標(biāo)菌在培養(yǎng)基上生長時，其特征性酶就能降解顯色底物并產(chǎn)生帶有特殊顏色的代謝物，使菌落形成特定的顏色或形態(tài)，而干擾菌被抑制或不產(chǎn)生特征性酶而不顯色，因而能被有效區(qū)別開來。使用顯色培養(yǎng)基對致病菌進行檢測能節(jié)省大量人力、財力和時間，也大大減少假陰性的機會，而且還能對目標(biāo)菌行定量檢測[18]。

本研究選擇我國主要流行的志賀氏菌-福氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌，通過實驗室常用的3種顯色培養(yǎng)基及木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（xylose lysine desoxycholate，XLD）培養(yǎng)基對福氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌的回收率、最低檢出限，以及對人工污染樣品的檢測效果進行比較，旨在選擇最適合實驗室使用的志賀氏菌檢測培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福氏志賀氏菌CICC21678、宋內(nèi)氏志賀氏菌CICC21679：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；志賀氏菌增菌肉湯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；顯色培養(yǎng)基01，由法國公司開發(fā)，由顯色培養(yǎng)基基礎(chǔ)及添加劑配制，志賀氏菌呈白色/清晰菌落，檢測時間為20～24h；顯色培養(yǎng)基02，由國內(nèi)生物技術(shù)公司開發(fā)，由顯色培養(yǎng)基基礎(chǔ)及顯色劑、瓊脂配制，志賀氏菌呈白色或無色菌落，檢測時間為20～24h；顯色培養(yǎng)基03購自國內(nèi)生物技術(shù)公司，由顯色培養(yǎng)基基礎(chǔ)及添加劑配制，志賀氏菌呈白色/清晰菌落，周圍培養(yǎng)基呈紅色，檢測時間為20～24h；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（XLD）瓊脂培養(yǎng)基購自國內(nèi)生物技術(shù)公司，志賀氏菌呈粉紅色至無色菌落，檢測時間為20h～24h。

羊肉（菌落總數(shù)：1.1×105CFU/g；大腸菌群：46 000MPN/100g）、奶粉（菌落總數(shù)：1.8×102CFU/g；大腸菌群<30MPN/100g）、果汁（菌落總數(shù)<10CFU/g；大腸菌群<30MPN/100g）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

DensiCHEK比濁儀：法國梅里埃公司；mini MACS厭氧工作站：英國Don Whitley Scientific公司；SEWARD3500拍擊式均質(zhì)器：英國SEWARD公司；MIR-254-PC低溫恒溫培養(yǎng)箱：日本Panasonic公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株回收率實驗

分別將福氏志賀氏菌CICC21678、宋內(nèi)氏志賀氏菌CICC21679新鮮培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋至濃度約為1× 108CFU/mL，進行10倍梯度稀釋，取10-6、10-7兩個梯度菌液各0.5mL，分別涂布營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（對照）、顯色培養(yǎng)基01、顯色培養(yǎng)基02、顯色培養(yǎng)基03、XLD培養(yǎng)基（試驗均做2個平行），37℃，24h培養(yǎng)后觀察結(jié)果，統(tǒng)計各培養(yǎng)基上生長的菌落總數(shù)，計算回收率，分離培養(yǎng)基回收率計算公式：

1.3.2 4種分離培養(yǎng)基最低檢出限對比

分別將福氏志賀氏菌CICC21678、宋內(nèi)氏志賀氏菌CICC21679新鮮培養(yǎng)物稀釋到不同濃度，添加到志賀增菌肉湯培養(yǎng)后對4種分離培養(yǎng)基進行最低檢出限對比。

1.3.3 人工污染樣品的檢測

菌液制備：將福氏志賀氏菌CICC21678、宋內(nèi)氏志賀氏菌CICC21679新鮮培養(yǎng)物制成菌懸液，福氏志賀氏菌分別為102CFU/mL、10CFU/mL；宋內(nèi)氏志賀氏菌分別為50CFU/mL、5CFU/mL。

樣品處理及檢測：分別取25g（或25mL）于225mL志賀氏菌增菌肉湯均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器連續(xù)均質(zhì)1～2min，液體樣品振蕩混勻即可。于41.5℃厭氧培養(yǎng)8～20h，相同條件下準(zhǔn)備2組平行樣。

分離：取增菌液分別劃線接種顯色培養(yǎng)基01、顯色培養(yǎng)基02、顯色培養(yǎng)基03、XLD培養(yǎng)基，比較幾種選擇性分離培養(yǎng)基對志賀氏菌的檢出效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 對志賀氏菌的檢出回收率對比

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長菌落總數(shù)理論上為每個分離培養(yǎng)基最多檢出的陽性志賀氏菌菌落數(shù)。

由表1、表2可看出，顯色培養(yǎng)基01對兩株志賀氏菌均為回收率最高，說明顯色培養(yǎng)基01對志賀氏菌的分離效果好。

表1 福氏志賀氏菌純菌回收率試驗結(jié)果Table 1 Recovery rate ofShigella flexneristrains on different medium

表2 宋內(nèi)氏志賀氏菌純菌回收率試驗結(jié)果Table 2 Recovery rate ofShigella sonneistrains on different medium

2.2 4種分離培養(yǎng)基對志賀氏菌最低檢出限對比

由表3、表4可知，4種分離培養(yǎng)基對福氏志賀氏菌最低檢出限均可達到8CFU/mL，對宋內(nèi)氏志賀氏菌最低檢出限均可達到5CFU/mL。

表3 分離培養(yǎng)基對福氏志賀氏菌的最低檢出限Table 3 Minimum detection limits ofShigella flexnerion different medium

表4 分離培養(yǎng)基對宋內(nèi)氏志賀氏菌的最低檢出限Table 4 Minimum detection limits ofShigella sooneion different medium

2.3 人工污染樣品檢測對比

由表5為福氏志賀氏菌添加，表6為宋內(nèi)氏志賀氏菌添加。由表5、表6可知，在檢測樣品中，顯色培養(yǎng)基01對福氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌檢測效果最好，且高污染樣品（羊肉）不同添加濃度在培養(yǎng)8h時，4種培養(yǎng)基均可檢出，而在培養(yǎng)20h后只有顯色培養(yǎng)基01可檢出，其余均無典型菌落生長。中污染（奶粉）、低污染樣品（果汁）在不同菌液濃度、不同培養(yǎng)時間無明顯差異。

表5 分離培養(yǎng)基檢測福氏志賀氏菌人工污染樣品結(jié)果比較Table 5 Comparison of isolation medium detecting artificially contaminated food withShigella flexneri

表6 分離培養(yǎng)基檢測宋內(nèi)氏志賀氏菌人工污染樣品結(jié)果比較Table 6 Comparison of isolation medium detecting artificially contaminated food withShigella soonei

在檢測樣品中，顯色培養(yǎng)基01對福氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌檢測效果最好，顯色培養(yǎng)基03、XLD次之，顯色培養(yǎng)基02最差。

高污染樣品（羊肉）在添加福氏志賀氏菌時不同濃度時，8h增菌培養(yǎng)后4種培養(yǎng)基均可檢出，而在培養(yǎng)20h后只有顯色培養(yǎng)基01檢出，而其他均被雜菌覆蓋，無法檢出；在添加宋內(nèi)氏志賀氏菌高于最低檢出限10倍濃度時，8h培養(yǎng)后均可檢出，20h后僅顯色培養(yǎng)基01和顯色培養(yǎng)基03可檢出，在添加最低檢出限濃度時僅顯色培養(yǎng)基01表現(xiàn)出較大優(yōu)勢。中污染（奶粉）樣品在8h檢測時2種志賀氏菌有個別無檢出，而20h培養(yǎng)后均可檢出。低污染（果汁）樣品在不同濃度不同培養(yǎng)時間均可檢出2種志賀氏菌，4種培養(yǎng)基之間無差異。本實驗結(jié)果表明在背景污染較重的樣品檢測時應(yīng)在8h、20h分別接種劃線分離（可幾種培養(yǎng)基同時聯(lián)合使用）以防止漏檢，而中污染、低污染樣品在20h培養(yǎng)后劃線分離即可。

3 結(jié)論

通過以上實驗結(jié)果可以看出，4種分離培養(yǎng)基對目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的生長和選擇均能達到基本性能要求，且不同濃度志賀氏菌在不同培養(yǎng)基上回收率不同以及不同食品種類、污染程度、增菌培養(yǎng)時間都對檢出效果有一定影響。志賀氏菌顯色培養(yǎng)基01在本研究中表現(xiàn)出較大的優(yōu)勢，為檢測效率和準(zhǔn)確度提供了保障。但是顯色培養(yǎng)基01在使用過程中也存在一些假陽性的問題，例如惡臭假單胞菌單從菌落形態(tài)上很難和志賀氏菌在顯色培養(yǎng)基01上進行區(qū)分，需要進行進一步的初步生化確證實驗。

使用方便、靈敏高效的顯色培養(yǎng)基成品及試劑盒將是微生物快速檢測新技術(shù)最有潛力的方向之一，但是顯色培養(yǎng)基在檢測食品樣品會遇到更多的挑戰(zhàn)，不僅干擾菌的種類更多更復(fù)雜，而且食品的成分和添加劑更可能影響顯色培養(yǎng)基的檢測特性。使用顯色培養(yǎng)基進行致病菌檢測時，應(yīng)該充分考慮樣品污染背景，選擇合適的增菌時間，從而避免漏檢和假陰性檢測結(jié)果的出現(xiàn)。

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Comparison of theShigella detection effect with four common culture media

WANG Jianchang,CHEN Zhimin,LI Jing,WANG Jinfeng,JIANG Yanfen,SUN Xiaoxia
(Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Technical Center,Shijiazhuang 050051,China)

Shigellais a common pathogenic species with highly contagious.Based on the national standard of GB 4789.5—2012,comparison among the detection effects of four common culture medium for isolatingShigellawas made.Through the comparison of four isolation medium forShigella flexneriandShigella sooneion recovery rate,limit of detection and detection effect,the detection effect of four media were evaluated.The results showed that the four media had the similar minimum detection limits,and the Chromogenic media 01 demonstrated better specificity in isolation than the other three.The pathogen isolation and culture conditions should be determined and chosen flexibly based on the property of the sample,in order to improve the accuracy and efficiency of detection.

Shigella flexneri;Shigella soonei;chromogenic media;detection effect comparison

R378.2

A

0254-5071（2014）03-0113-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.027

2014-01-05

國家級質(zhì)檢公益行業(yè)科研專項項目（201210128）

王建昌（1981-），男，博士，主要從事食品微生物、進出境動物及動物產(chǎn)品檢測工作。