天山雪菊不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

劉博奧，劉繼國(guó)，劉偉，潘曉博，祁英，劉玉梅*

（新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

天山雪菊不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

劉博奧，劉繼國(guó)，劉偉，潘曉博，祁英，劉玉梅*

（新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

以天山雪菊為原料，經(jīng)過(guò)超臨界二氧化碳萃取后，萃余物又分別采用丙酮、體積分?jǐn)?shù)分別為50%、95%乙醇進(jìn)行提取，獲得不同溶劑提取的4種天山雪菊提取物，比較不同溶劑提取物的抗氧化活性。通過(guò)對(duì)二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基和羥基自由基清除能力的評(píng)價(jià)，比較各種提取物的抗氧化活性，并對(duì)各種提取物中的總多酚和總黃酮的含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，4種提取物對(duì)DPPH自由基均具有較強(qiáng)清除活性，但活性弱于對(duì)照品二丁基羥基甲苯（BHT）、水溶性維生素E（Trolox）、α-生育酚和Vc；對(duì)羥基自由基的清除能力低于對(duì)照品蘆丁和BHT。清除DPPH自由基的能力以體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇提取物最強(qiáng)，超臨界浸膏最弱；清除羥基自由基的活性以體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇提取物最強(qiáng)，丙酮提取物最弱。

天山雪菊；抗氧化；黃酮；多酚；羥基自由基；DPPH自由基

天山雪菊（Coreopsis tinctoriaNutt.）又稱(chēng)兩色金雞菊，一年生草本植物，高30～60cm[1]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，天山雪菊中含有的大量黃酮類(lèi)化合物，具有較高的生物活性，可應(yīng)用于功能性食品[2]?，F(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究表明，生命體中細(xì)胞的退化、衰老和癌變等現(xiàn)象的發(fā)生可能與自由基有關(guān)，自由基的形成與發(fā)展多與氧細(xì)胞的正常代謝有關(guān)，細(xì)胞在氧化過(guò)程中產(chǎn)生例如單線態(tài)氧自由基、羥基自由基和過(guò)氧自由基等自由基一旦泄露到細(xì)胞外，即可能與生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸分子相互作用從而對(duì)其產(chǎn)生毒害[3]。20世紀(jì)80年代以來(lái)，對(duì)黃酮類(lèi)化合物的研究逐漸轉(zhuǎn)向關(guān)注其清除自由基和抗氧化能力等[4]。雪菊富含黃酮和多酚類(lèi)化合物，研究其各種提取物的抗氧化和清除自由基的能力可為雪菊的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

本研究首先采用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)獲得了天山雪菊的脂溶性提取物。由于超臨界二氧化碳萃取具有操作條件溫和、活性成分不易被破壞、無(wú)有機(jī)溶劑殘留的優(yōu)點(diǎn)[5-7]，其萃余物又分別采用丙酮及體積分?jǐn)?shù)分別為50%、95%的乙醇等不同溶劑進(jìn)行提取，獲得雪菊不同溶劑的提取物，在分析了各種提取物中的總多酚和總黃酮的前提下，對(duì)天山雪菊的各種提取物清除羥基自由基和DPPH自由基的清除能力進(jìn)行了研究，旨在為天山雪菊的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天山雪菊：市售，產(chǎn)地新疆和田地區(qū)，低溫干燥保存，使用前粉碎。CO2：新疆山下科技有限公司提供；二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazy1，DPPH）、福林-酚試劑、α-生育酚、水溶性維生素E（Trolox）、維生素C：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；蘆?。褐袊?guó)藥品生物制品檢定所；二丁基羥基甲苯（butylatecl hyclroxy toluene，BHT）、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、雙氧水、磷酸鹽等其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SFE230-50-06型超臨界流體萃取裝置：江蘇海安華達(dá)石油儀器有限公司；UV5300PC型紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)：上海元析分析儀器廠；668型真空干燥箱：大連第四儀表廠；DHP-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；BS210S型電子天平：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

超臨界二氧化碳萃取浸膏制備：在萃取溫度60℃、萃取壓力25MPa、CO2流速為35L/h的條件下采用超臨界CO2萃取裝置提取天山雪菊脂溶性提取物（提取率為10.67%），得到超臨界CO2萃取浸膏樣品，萃余物留作溶劑提取。測(cè)定時(shí)稱(chēng)取一定質(zhì)量的浸膏溶解在甲醇溶劑中配制到實(shí)驗(yàn)所需的濃度。

溶劑提取物制備：超臨界二氧化碳萃取的萃余物，精確稱(chēng)取1.0000g，置于50mL錐形瓶中，分別用丙酮及體積分?jǐn)?shù)為50%、95%的乙醇等溶劑各15mL萃取，每次萃取30min（期間超聲波輔助提取15min）；真空抽濾，濾渣重復(fù)提取2次。過(guò)濾后合并濾液，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中用相應(yīng)的萃取溶劑定容，混合均勻，測(cè)定時(shí)根據(jù)需要進(jìn)行相應(yīng)的稀釋處理。

1.3.2 總黃酮含量的測(cè)定

采用AlCl3比色法測(cè)定[8]，以105℃預(yù)先烘至質(zhì)量恒定的蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)定量。準(zhǔn)確稱(chēng)取109.1mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于100mL的容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇超聲溶解后，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇定容至刻度，搖勻，此為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10mL于50mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇溶液稀釋至刻度，混合均勻（含無(wú)水蘆丁0.218mg/mL），此為標(biāo)準(zhǔn)母液。準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)母液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL分別置于25mL容量瓶中，分別補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇至溶液體積為10mL，精確加入1mL 5%的NaNO2溶液，避光保存1h，加入1mL10%的Al（NO3）2，混勻，放置6min；再加入10mL1mol/L的NaOH溶液，用蒸餾水定容；搖勻后靜置反應(yīng)15min。以不加標(biāo)準(zhǔn)樣品的溶液同上述步驟制備參比，在λ=510nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)A510nm吸光值對(duì)應(yīng)蘆丁質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將上述步驟中加入的1.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液改為1.0mL樣品溶液，其余測(cè)定步驟同標(biāo)準(zhǔn)，獲得樣品溶液的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮的濃度。

1.3.3 總多酚含量的測(cè)定

采用福林-酚比色法（Folin-Ciocalteu）測(cè)定[9]，以真空干燥至質(zhì)量恒定的沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取44.3mg的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容后搖勻，此為標(biāo)準(zhǔn)原液。以此溶液配制成質(zhì)量濃度分別為8.86mg/L、17.72mg/L、35.44mg/L、70.88mg/L、88.60mg/L、106.32mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取1mL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，依次加入1mL去離子水，0.5mL已用去離子水稀釋2倍的福林-酚試劑，搖勻靜置5min后移入1.5mL 20%的Na2CO3溶液，用去離子水定容至刻度，混合均勻后在室溫條件下避光反應(yīng)2h。在λ=760nm處測(cè)其吸光度值，以A760nm吸光值對(duì)應(yīng)沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到總多酚測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將上述測(cè)定步驟中加入的1mL標(biāo)準(zhǔn)溶液改為加入1mL樣品溶液，即可得到樣品溶液的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算樣品中的總多酚濃度。

1.3.4 羥基自由基的清除能力測(cè)定

采用鄰二氮菲-二價(jià)鐵氧化法[10]。Fenton反應(yīng)可以使H2O2-Fe2+體系產(chǎn)生羥基自由基，H2O2-Fe2+水溶液可以被羥基自由基氧化為鄰二氮菲-三價(jià)鐵，反應(yīng)后其在536nm處最大吸收峰消失，據(jù)此可推算體系中羥基自由基的變化。實(shí)驗(yàn)步驟如下：稱(chēng)取1.486 7g鄰二氮菲，用100mL無(wú)水乙醇配制成0.075mol/L鄰二氮菲醇溶液，使用前用重蒸水稀釋100倍。取1mL樣品于20mL試管中，依次加入1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲，pH=7.4的0.2mmol/L磷酸鹽緩沖溶液2mL，濃度為0.75mmol/L FeSO4溶液1mL。充分搖勻，置于37℃保溫箱中保溫1h。取出后冷卻，以重蒸水作空白，測(cè)其536nm波長(zhǎng)下吸光度值A(chǔ)（樣）。損傷管加入1mL 0.1%的H2O2用來(lái)代替樣品管中的1mL樣品A（損）；未損傷管用2mL重蒸水分別代替樣品管中1mL樣品的和1mL的H2O2，記為A（未）。

式中：A（樣）表示樣品管的吸光度值；A（損）表示損傷管的吸光度值；A（未）表示未損傷管的吸光度值。

1.3.5 DPPH自由基的清除能力測(cè)定

二苯基苦基苯肼（DPPH）是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其甲醇溶液呈深紫色，在517nm處有強(qiáng)吸收，若加入抗氧化物質(zhì)，其單電子被配對(duì)[11-12]，紫外可見(jiàn)光區(qū)517nm處最大吸收峰消失，據(jù)此可測(cè)定對(duì)DPPH的清除效果。用甲醇配制成0.04mg/mL的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1mL質(zhì)量濃度在0.02～4.00mg/mL的樣品于試管中，加入DPPH溶液3mL，充分混勻，放置1h。用1mL甲醇作為空白對(duì)照組代替樣品，在517nm處測(cè)其吸光度值。

式中：A（樣）表示添加樣品時(shí)溶液吸光度值；A（控）表示未添加樣品時(shí)溶液的吸光值。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理及統(tǒng)計(jì)分析均是采用Microsoft Excel或OriginPro8.0專(zhuān)業(yè)軟件來(lái)處理的，數(shù)據(jù)表示為平均值（n≥3）±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

采用蘆丁比色法，以蘆丁質(zhì)量濃度C-吸光度值A(chǔ)510nm作圖，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1（A），標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為C=2.097 3A510nm-0.001 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，線性范圍0.255～2.041mg/mL。采用福林酚比色法，以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度-吸光度值A(chǔ)760nm作圖，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1（B），標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為C=82.8500A760nm-3.4615，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8，線性范圍8.8～106.3mg/L。

圖1 蘆丁(A)和沒(méi)食子酸(B)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin(A)and gallic acid(B)

2.2 雪菊不同溶劑提取物中的總多酚和總黃酮的含量

多酚和黃酮類(lèi)物質(zhì)在自然界分布廣泛，且大多具有非常強(qiáng)的抗氧化活性，是人們自飲食攝入最多的抗氧化物質(zhì)[13]。大量研究也表明，總多酚和總黃酮的含量高低與抗氧化活性的強(qiáng)弱有明顯的相關(guān)性[14]。菊科植物多含有多種多酚和黃酮類(lèi)化合物[15]，由于不同種類(lèi)的多酚和黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶解性質(zhì)不同，采用不同的溶劑提取得到的提取物中所含多酚和黃酮的種類(lèi)和數(shù)量也會(huì)有差異。因此，為了綜合評(píng)價(jià)雪菊不同溶劑提取物的抗氧化活性，試驗(yàn)中首先對(duì)各種雪菊提取物中總多酚和總黃酮類(lèi)化合物含量進(jìn)行了分析檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 雪菊不同提取物的總多酚和總黃酮含量的分析Table 1 Contents of total polyphenol and total flavonoids from different extractions ofC.tinctoria

由表1可知，丙酮萃取物中黃酮類(lèi)和多酚類(lèi)化合物含量最低，體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇萃取物中黃酮類(lèi)和多酚類(lèi)化合物含量次之，體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇萃取物中黃酮和多酚化合物的含量最高；體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇提取的雪菊提取物中的總多酚和總黃酮的含量分別為丙酮提取物的5.4倍和4.9倍，約為體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇提取物的2倍左右。

2.3 雪菊不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力的評(píng)價(jià)

DPPH在有機(jī)溶劑中以一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基而存在，當(dāng)體系中加入受測(cè)物有一定的自由基清除能力時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)，吸收消失或減弱，其清除率活性的高低可通過(guò)測(cè)定吸收減弱的程度來(lái)評(píng)價(jià)。清除活性通常以清除體系中50%DPPH自由基的半數(shù)清除率（concentrationfor 50%ofmaximaleffect，EC50）值作為衡量手段，該值越小樣品清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)。圖2為不同溶劑的雪菊提取物在不同的質(zhì)量濃度下對(duì)DPPH自由基的清除率的劑量曲線，曲線斜率越大，則對(duì)DPPH自由基的清除能力越強(qiáng)。合成抗氧化劑BHT、VC、Trolox及天然來(lái)源的α-生育酚作為對(duì)照，因VC、Trolox及α-生育酚的曲線與BHT近似，為避免曲線重疊，圖2中僅列出BHT曲線作為對(duì)照。

圖2 雪菊不同溶劑提取物清除DPPH自由基的清除率Fig.2 DPPH free radical scavenging rate of different extractions of C.tinctoria

由圖2可知，雪菊的4種提取物均具有清除DPPH自由基的作用，且隨著提取物質(zhì)量濃度的增加，清除能力均逐漸增加，但與對(duì)照品BHT相比，體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇提取物和體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇提取物略低，而丙酮提取物與超臨界浸膏的清除活性遠(yuǎn)小于上述對(duì)照品，樣品清除DPPH自由基的半數(shù)清除率見(jiàn)表2。

表2 雪菊不同溶劑提取物清除DPPH自由基的半數(shù)清除率（EC50值）Table 2 Hydroxyl radical scavenging activity（EC50）of different extractions ofC.tinctoria

由表2可知，樣品清除DPPH自由基能力大小依次為：體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇提取物>體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇提取物>丙酮提取物>超臨界CO2浸膏，但樣品的半數(shù)清除率均小于對(duì)照品，特別是超臨界CO2浸膏，清除率僅為各對(duì)照品的1%～2%。

2.4 雪菊提取物清除羥基自由基能力的評(píng)價(jià)

在體外實(shí)驗(yàn)體系中，通過(guò)評(píng)價(jià)羥基自由基清除能力來(lái)選擇抗氧化劑具有重要意義。由于羥基自由基氧化反應(yīng)具有一定累積性，隨著反應(yīng)時(shí)間的變化其吸光度值呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)，反應(yīng)1h左右基本趨于穩(wěn)定，因此，實(shí)驗(yàn)中選擇了1h的反應(yīng)時(shí)間。BHT和蘆丁作為對(duì)照（因蘆丁的質(zhì)量濃度范圍非常窄，為避免曲線重疊，圖3中沒(méi)有表示蘆丁曲線），雪菊不同溶劑提取物清除羥基自由基的曲線見(jiàn)圖3。

圖3 雪菊不同提取物清除羥基自由基的清除率Fig.3 Hydroxyl free radical scavenging rate of different extractions of C.tinctoria

由于超臨界CO2浸膏不溶于羥基自由基的測(cè)定體系，因此未評(píng)價(jià)該浸膏對(duì)羥基自由基的清除率。由圖3可知，樣品清除羥基自由基的能力為：體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇提取物>體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇提取物>丙酮提取物。3種提取物中以體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇提取物對(duì)羥基自由基的清除能力最強(qiáng)，但清除效果弱于對(duì)照品BHT。

羥基自由基的清除能力通常用清除體系中的50%羥自由基的半數(shù)清除率值EC50來(lái)表示。EC50值越小，則樣品清除羥基自由基能力越強(qiáng)，蘆丁和BHT作為對(duì)照，樣品及對(duì)照品清除羥基自由基的半數(shù)清除率見(jiàn)表3。

表3 雪菊不同溶劑提取物清除羥基自由基的半數(shù)清除率（EC50值）Table 3 Half hydroxyl free radical scavenging ratio(EC50)of different extractions ofC.tinctoria

由表3可知，樣品的半數(shù)清除率EC50值均明顯高于對(duì)照品BHT和蘆丁，說(shuō)明上述提取物對(duì)羥基自由基的清除能力要弱于對(duì)照品對(duì)羥基自由基的清除能力。

3 結(jié)論

對(duì)天山雪菊的超臨界CO2浸膏、體積分?jǐn)?shù)分別為50%、95%乙醇提取物和丙酮提取物的體外抗氧化活性的對(duì)比研究表明，4種提取物均具有比較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，其中體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇提取物清除活性高于體積分?jǐn)?shù)為95%的提取物清除活性，明顯高于丙酮提取物和超臨界CO2浸膏，與提取物中所含總多酚和總黃酮呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。對(duì)羥基自由基的清除活性也表明，體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇提取物清除活性也高于體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇提取物及丙酮提取物。清除DPPH自由基的能力和羥基自由基的能力強(qiáng)弱順序一致，均為體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇提取物清除能力最強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雪菊中總黃酮以極性較強(qiáng)的黃酮苷類(lèi)為主，提取其中的總黃酮和總多酚類(lèi)物質(zhì)應(yīng)選擇體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇提取可獲得具有更強(qiáng)抗氧化活性的組分。

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Antioxidant activity of different solvent extracts fromCoreopsis tinctoria

LIU Boao,LIU Jiguo,LIU Wei,PAN Xiaobo,QI Ying,Liu Yumei*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Xinjiang University,Urmuqi 830046,China)

To compare the antioxidant activity of different solvent extracts fromCoreopsis tinctoria,theC.tinctoriasample was extracted by supercritical CO2extraction,and then the residue was extracted by acetone,followed by 95%ethanol and 50%ethanol,respectively.Four kinds ofC.tinctoriasolvent extracts were obtained and the antioxidant activity was evaluated.The DPPH free radical scavenging activity and hydroxyl radical scavenging activity were evaluated and the content of flavonoids and polyphenols were analyzed for comparison.The results showed that all those extracts had strong antioxidant activity on DPPH free radicals,but all lower than the activities of butylated hydroxytoluene(BHT),trolox,α-tocopherol and vitamin C.The antioxidant activity of extracts on hydroxyl free radical was lower than rutin and BHT.Among the extracts,the one extracted by 50% ethanol had the highest antioxidant activity on DPPH free radicals;however,the one extracted by supercritical CO2extraction had the lowest activity. In addition,the one extracted by 50%ethanol had the highest antioxidant activity on hydroxyl free radicals,and the one extracted by acetone had the lowest activity.

Coreopsis tinctoria;antioxidant activity;flavonoids;polyphenols;hydroxyl radicals;DPPH radicals

R285.5

A

0254-5071（2014）03-0071-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.018

2014-01-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31360403）；新疆大學(xué)本科生科研實(shí)踐訓(xùn)練項(xiàng)目（XJU-SRT-09041）

劉博奧（1992-），男，本科生，研究方向?yàn)閼?yīng)用化學(xué)。

*通訊作者：劉玉梅（1965-），女，教授級(jí)高工，博士，研究方向?yàn)槭称饭δ芤蜃印?/p>