谷氨酸對地衣芽孢桿菌產桿菌肽的影響

鮑帥帥，張默，王新平，陳雄，陳守文，李俊輝，李冬生，王志*

（1.湖北工業(yè)大學生物工程學院，湖北武漢430068；2.華中農業(yè)大學綠康生物工程研究所，湖北武漢430070；3.綠康生化股份有限公司，福建浦城353400）

谷氨酸對地衣芽孢桿菌產桿菌肽的影響

鮑帥帥1，張默1，王新平1，陳雄1，陳守文2，李俊輝3，李冬生1，王志1*

（1.湖北工業(yè)大學生物工程學院，湖北武漢430068；2.華中農業(yè)大學綠康生物工程研究所，湖北武漢430070；3.綠康生化股份有限公司，福建浦城353400）

研究了發(fā)酵過程中添加谷氨酸對菌體代謝和桿菌肽合成的影響。搖瓶發(fā)酵過程中添加0.03g/L谷氨酸，桿菌肽產量增加13.4%，而10L發(fā)酵罐發(fā)酵16h添加0.03g/L谷氨酸，桿菌肽效價在36h達到峰值。發(fā)酵16～26h以3mg/（L·h）流加谷氨酸，桿菌肽16～34h的合成速率是34.0U/（mL·h），比對照組提高55.3%；同時，生物量16～30h增長速率是20.2μg/（mL·h），比對照組提高了17.4%，但是菌體自溶時間比對照提前了6h。NO2-濃度在18～32h高于對照組11.4%～154.9%，揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度在22～32h低于對照組10.3%～94.8%。說明流加谷氨酸起到了調控因子的作用，通過生成NO2-增加了NADH的消耗，降低了VFA的生成，刺激了菌體在發(fā)酵中前期的生長；谷氨酸同時也參與到了桿菌肽的合成，加快了桿菌肽的積累。

地衣芽孢桿菌；桿菌肽；谷氨酸；生長因子；合成前體

桿菌肽是由一些地衣芽胞桿菌和枯草芽孢桿菌菌株產生的多肽類抗生素，并被國內外廣泛用作飼料添加劑[1]。桿菌肽分子是由谷氨酸、賴氨酸、鳥氨酸等12個氨基酸組成的含有噻唑環(huán)的多肽復合體[2]。因此，氨基酸的代謝在桿菌肽的生物合成中起著重要作用，如Lys、Asn、Phe、Ile、Leu、Asp、Cys等對生長有明顯的促進作用[3]。而谷氨酸、谷氨酰胺又是細胞氮代謝的重要中轉站，發(fā)酵過程中添加的外源谷氨酸，可以促進鳥氨酸等氨基酸的合成過程[4]、增加谷氨酰胺供量以增加細胞代謝所需氮的供給[5]以及為桿菌肽合成提供前體[6]。

另外，由于地衣芽孢桿菌濁液發(fā)酵產桿菌肽細胞濃度高、發(fā)酵液黏稠，造成了細菌在發(fā)酵中后期處于缺氧的環(huán)境[7]。而地衣芽孢桿菌是典型的兼性厭氧菌，細胞為了平衡NADH/NAD+，可通過生成丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）[8]來消耗NADH。另外，地衣芽孢桿菌具有同化型硝酸鹽還原系統(tǒng)（將NO3-還原生成NO2-并生成NH4+）[9]，可以通過硝酸鹽呼吸消耗NADH[10]。VFA和NO2-的濃度變化可以反映細胞的氧化還原狀態(tài)。

本實驗研究了谷氨酸的添加對氧限制條件下地衣芽孢桿菌生長、代謝以及桿菌肽合成的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 培養(yǎng)基

（1）種子斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L，牛肉提取物3g/L，酵母抽提物2g/L，NaCl 5g/L，瓊脂15g/L，37℃培養(yǎng)24h。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆粉50g/L，淀粉40g/L，碳酸鈣4g/L，硫酸銨0.7g/L，蛋白胨10g/L。

1.1.2 菌種來源

地衣芽孢桿菌LC-11（Bacillus licheniformisLC-11）由華中農業(yè)大學綠康生物工程研究所提供。

1.2 儀器與設備

SPX-150D型恒溫生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；UV-722型紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司分析儀器總廠；TGL-20臺式高速離心機：武漢中科科儀技術發(fā)展有限責任公司；1200高效液相色譜：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

10L罐培養(yǎng)：裝料5L，接種量10%（v/v），空氣流量600L/h，轉速300r/min，37℃培養(yǎng)42h左右。

1.3.2 樣品處理方法

發(fā)酵過程中，周期取10mL發(fā)酵液，液氮凍存。解凍后在10 000r/min、4℃條件下離心30min，上清液用于代謝物檢測。

1.3.3 桿菌肽的檢測

取預處理后的上清液1mL，加入體積分數50%乙醇4mL，振蕩3min搖勻，再10 000r/min離心5min，取上清液0.22μm過濾，濾液用于高效液相色譜法檢測桿菌肽的含量[11]。

1.3.4 NO2-的測定方法

在弱酸條件下，亞硝酸根離子與對氨基苯磺酸重氮化合物反應，產物與鹽酸萘乙二胺偶合生成紫紅色的重氮化合物，采用分光光度法測定NO2-的濃度[12]。

1.3.5 生物量的測定

采用二苯胺法測定培養(yǎng)液中DNA的含量[13]，用DNA的含量表征生物量。

1.3.6 VFA的測定方法

揮發(fā)性脂肪酸與乙二醇在加熱條件下反應生成酯，生成的酯再與羥胺反應生成氧肟酸，在高鐵試劑存在的條件下氧肟酸與高鐵離子反應形成棕紅色的絡合物。利用此顏色反應可以測定揮發(fā)酸的含量[14]。

2 結果與分析

2.1 搖瓶培養(yǎng)20h添加谷氨酸對桿菌肽合成的影響

圖1 搖瓶培養(yǎng)20h添加谷氨酸對桿菌肽效價的影響Fig.1 Effect of glutamic acid addition at 20h on bacitracin production in shake flasks

在搖瓶發(fā)酵20h時分別添加終濃度0.01g/L、0.03g/L、0.05g/L、0.07g/L的谷氨酸，發(fā)酵48h后檢測發(fā)酵液的效價如圖1所示。添加不同濃度的谷氨酸都對桿菌肽的合成起到了促進作用，谷氨酸添加量為0.03g/L時桿菌肽效價達到759U/mL，比對照提高了13.4%，說明適量添加谷氨酸能夠有效提高地衣芽孢桿菌產桿菌肽的效率。

2.2 10L罐發(fā)酵16h添加谷氨酸（0.03g/L）對生長和桿菌肽合成的影響

圖2 10L罐培養(yǎng)16h添加0.03g/L谷氨酸對桿菌肽產量的影響Fig.2 Effect of glutamic acid addition(0.03g/L)on bacitracin production in a 10L bioreactor cultivated for 16h

由于桿菌肽在搖瓶和發(fā)酵罐發(fā)酵的周期不同，通過搖瓶發(fā)酵的添加時間占總發(fā)酵時間的比例換算（搖瓶添加時間×發(fā)酵罐發(fā)酵總時間/搖瓶發(fā)酵時間）確定在16h向罐中補加谷氨酸。如圖2所示：添加組桿菌肽效價在發(fā)酵36h達到最大856U/mL，并且隨時間延長生物量（以DNA含量表示）開始減少；而對照組效價38h達到最大值923U/mL，且生物量開始減少。雖然發(fā)酵效價達到最高峰的時間縮短了2h，但是添加組桿菌肽效價卻較對照降低了7.3%。而且添加對細胞的后期生物量產生了抑制作用，其生物量在34～38h低于對照2.8%～30.9%，而且38h開始急劇下降，40h比對照降低了30.9%。說明一次性添加谷氨酸對菌體生長和代謝干擾大，后期生物量明顯低于對照，而且菌體自溶時間比對照提前了2h。因此，采用連續(xù)流加的方式考察谷氨酸對細胞生長、代謝和桿菌肽合成的影響。

2.3 10L罐16h流加谷氨酸對桿菌肽合成的影響

圖3 10L罐培養(yǎng)16～26h過程中以3mg/（L·h）的速率流加谷氨酸對桿菌肽產量和生物量的影響Fig.3 Effect of glutamic acid addition from 16h to 26h at the rate of 3mg/（L·h）on bacitracin production and biomass in a 10L bioreactor

由圖3可知，從16h開始以3mg/（L·h）速率流加谷氨酸（總量不變，流加10h），桿菌肽的合成速率（16～34h）是34.0U/（mL·h），比對照21.9U/（mL·h）顯著提高55.3%，效價高點（34h）比對照（38h）提前了4h。添加組生物量的增長速率（16～30h）是20.2μg/（mL·h），比對照組的17.2μg/（mL·h）提高了17.4%，并在30h開始自溶，比對照提前了6h。說明流加的谷氨酸既刺激了菌體在發(fā)酵中前期的生長，也參與到了桿菌肽的合成，加快了桿菌肽的積累，且桿菌肽效價到了1 020U/mL，比對照提高9.6%。

2.4 10L罐發(fā)酵過程VFA和NO2-的變化規(guī)律

圖4 10L罐培養(yǎng)過程中以0.3mg/（L·h）的速率流加谷氨酸10h對VFA和NO2-(平均值±標準偏差)的影響Fig.4 Effect of training process with glutamic acid addition rate of 0.3mg/（L·h）for 10h on VFA and NO2-with standard deviation in a 10L fermenter

10L罐發(fā)酵過程中VFA和NO2-的變化如圖4所示，對照組和添加組的NO2-濃度變化情況基本相同，分別在14h達到最高濃度52.5mmol/L和54.2mmol/L，并在18h分別降至最低值6.67mmol/L和7.43mmol/L，之后回升。這可能是由于菌體在發(fā)酵前期快速生長（圖3），導致培養(yǎng)系統(tǒng)中的菌體處于缺氧狀態(tài)，地衣芽孢桿菌的硝酸鹽呼吸代謝啟動，使NO2-濃度迅速提高，后隨著NO2-的進一步代謝而快速降低。18h后，NO2-濃度變化出現顯著差異，18～34h，添加組的NO2-濃度是7.43～34.69mmol/L，顯著高于對照11.4%～154.9%。同時，22～34h，添加組的VFA是0.25～4.53g/L，低于對照10.3%～94.8%，說明細胞通過硝酸鹽呼吸代謝消耗了NADH，減少了小分子揮發(fā)酸的生成[5]。18h后NO2-迅速積累，說明谷氨酸起到了調控因子的作用，促進了硝酸根的還原、增加了NADH的消耗，分流了細胞通過產生VFA所消耗的NADH，導致添加組的VFA的水平遠低于對照組的水平[15]。

3 結論

在利用地衣芽胞桿菌發(fā)酵產桿菌肽的過程中，16～26h以3mg/（L·h）流加谷氨酸可以有效提高桿菌肽的產量，放罐效價達到1 020U/mL，且縮短了發(fā)酵周期約4h。實驗結果顯示，谷氨酸還促進了硝酸還原酶的活性，提高細菌在缺氧條件下的生存能力。至于谷氨酸是如何提高硝酸還原酶的活性的，還有待進一步研究。

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Effect of glutamate addition on bacitracin production byBacillus licheniformis

BAO Shuaishuai1,ZHANG Mo1,WANG Xinping1,CHEN Xiong1,CHEN Shouwen2,LI Junhui3,LI Dongsheng1,WANG Zhi1*
(1.College of Biotechnology,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China; 2.Lifecome Bioengineering Institute of Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China; 3.Lifecome Biochemistry Co.,Ltd.,Pucheng 353400,China)

Effect of glutamate addition on bacteria metabolism and bacitracin synthesis during fermentation was studied.The bacitracin production increased 13.4%after adding 0.03 g/L glutamate acid into shaker flask during fermentation.The fermentation in 10 L bioreactor was conducted, 0.03 g/L glutamic acid was added into the bioreactor at the 16 h of fermentation,and the bacitracin titer reached the highest at the 36 h.During the 16-26 h of fermentation,glutamic acid was added at the rate of 3 mg/ml,the synthetic rate of bacitracin in 16-34 h was 34.0 U/(ml·h),increased 55.3% than the control group.Meanwhile,the increase rate of biomass was 20.2 μg/(ml·h),increased 17.4%than the control group,but the autolyzed time decreased 6 h.NO2-content was 11.4%to 154.9%higher than the control group from 18 h to 32 h.However,the volatile fatty acids content from 18 h to 32 h was 10.3%-94.8%lower than the control group from 22 h to 32 h.The results suggested that glutamic acid played an important role in regulating factors;it enhanced the NADH oxidation efficiency through NO2-synthesis,reduced the volatile fatty acids production,stimulated cell growth and favored bacitracin production in the end.

Bacillus licheniformis;bacitracin;glutamate acid;growth factor;synthesis precursor

TQ465

A

0254-5071（2014）03-0049-03

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.013

2014-01-21

華中農業(yè)大學綠康生物工程研究所科技攻關項目（2011090121）

鮑帥帥（1989-），男，碩士研究生，主要從事發(fā)酵工程的研究工作。

*通訊作者：王志（1971-），男，副教授，博士，主要從事代謝工程的研究工作。