山桃稠李果實花色苷對Nrf2/Keap1通路的影響

劉 榮，姜元松，辛 越，王 蕾，楊巍巍

（東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

山桃稠李（Padus maackii）為薔薇科稠李屬的三種植物，在我國南北部地區(qū)均有分布生長，是多年生的落葉喬木[1]。我國學(xué)者在此植物的種植技術(shù)等方面研究頗多，而對其果實的花色苷抗氧化機制的研究利用未見報道。

本實驗以山桃稠李果實花色苷作為抗氧化酶的誘導(dǎo)物，探究花色苷作用于HepG2細(xì)胞后，抗氧化系統(tǒng)的分子機制。從mRNA水平上分析花色苷對HepG2細(xì)胞的GSTP1、Nrf2、Keap1的基因表達(dá)的影響，探討PI3K-Nrf2/Keap1信號通路在HepG2細(xì)胞抗氧化機制中的作用，以期為今后研究山桃稠李果實花色苷提供理論依據(jù)。

目前研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控抗氧化酶的表達(dá)的途徑較多，其中誘導(dǎo)物對Nrf2/Keap信號通路的調(diào)控的途徑研究的比較明確[2-3]。在正常狀態(tài)下，Nrf2/Keap1復(fù)合物被控制在胞漿中，當(dāng)受到誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)后，Nrf2從Nrf2/Keap1復(fù)合物上解偶聯(lián)釋放，進入核內(nèi)與ARE相互作用，促進抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄。并且研究表明，磷酯酰肌醇-3-激酶（phosph oinositol-3-kinase，PI3K）能夠激活Nrf2使其進入細(xì)胞核，并引起抗氧化基因表達(dá)上調(diào)[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肝癌HepG2細(xì)胞 哈醫(yī)大腫瘤醫(yī)院饋贈；山桃稠李 哈爾濱雙環(huán)園林采摘；小牛血清 杭州四季青產(chǎn)品；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO） Sigma進口分裝；改良型RPM I 1640培養(yǎng)基 賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；胰蛋白酶（2×105U/g） Sigma公司；雙抗試劑（100U/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素）北京索萊寶試劑公司；磷酯酰肌醇-3-激酶（PI3K）、焦炭酸二己醋（DEPC） Sigma公司；Trizol氯仿、總RNA提取試劑盒 北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；RT-PCR試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；2000bPDNALadder 寶生物工程有限公司。

DF-110型電子分析天平 中國輕工業(yè)機械總公司；GL-16G-C型高速冷凍離心機 上海科興儀器有限公司；低溫冰箱 美國FORMA公司；酶標(biāo)儀 美國Biocell公司；CO2培養(yǎng)箱 Thermo Forma公司；倒置顯微鏡 Nikon公司；ABI PRISM 7500型熒光定量PCR擴增儀 App lied Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花色苷的制備 分別取山桃稠李果實適量剪枝，榨汁，同pH=2的酸化乙醇按照料液比1∶4（W∶V）混合，提取2次，每次提取12h，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后，經(jīng)X-5大孔樹脂上柱純化，減壓濃縮，真空冷凍干燥得到山桃稠李果實花色苷粉末，-20℃保存。實驗時將山桃稠李果實花色苷用PBS緩沖液稀釋到一定濃度，0.22μm濾膜過膜備用[5]。

1.2.2 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的HepG2細(xì)胞迅速放入37℃水浴1m in，并不斷搖動使其解凍。1000r/m in離心5m in，吸取上清液，培養(yǎng)于改良型RPMI 1640培養(yǎng)基中加入l00U/m L青霉素，100μg/m L鏈霉素以及10%的滅活胎牛血清的培養(yǎng)液中。將細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，HepG2細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶貼壁生長，每種培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞均大于3次，每3～4d傳代一次。

1.2.3 MTT法檢測HepG2細(xì)胞生長抑制率 參照文獻[6]，取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105Cell/m L，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，將未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對照組，質(zhì)量濃度為0.05、0.2、0.8mg/m L的花色苷的細(xì)胞作為處理組，只加花色苷和培養(yǎng)液而不含細(xì)胞的為空白組。其中處理組、對照組及空白組每個濃度各設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入10μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加入150μL DMSO，利用酶標(biāo)儀在490nm測A值，并計算細(xì)胞的生長抑制率。公式如下：

細(xì)胞生長抑制率（%）=[1-（處理組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）]×100

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)GSH含量與GSH-ST、PI3K活性的測定

參照文獻[7]的作法并有所改進，取對數(shù)生長期的細(xì)胞105Cell/m L均勻鋪于24孔板，待細(xì)胞貼壁生長后更換培養(yǎng)液，實驗組加入質(zhì)量濃度為0.05、0.2、0.8mg/m L的山桃稠李果實花色苷的培養(yǎng)液，對照組加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍，胰酶消化，1000r/m in離心5m in后收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心后得細(xì)胞上清液，取適量進行蛋白質(zhì)含量測定。按試劑盒說明進行操作，測定GSH含量與GSH-ST、PI3K活性。

1.2.5 山桃稠李花色苷對Nrf2/Keap1的基因表達(dá)的影響 實時熒光定量RT-PCR實驗方法檢測山桃稠李果實苷對HepG2細(xì)胞的Nrf2、Keap1、GSTP1的基因表達(dá)的影響。Gene Bank中找到Nrf2、Keap1、GSTP1基因序列，并利用加拿大Prem ier公司的Primer primer 5.0引物設(shè)計軟件進行引物的設(shè)計，委托博仕生物公司進行合成。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定總RNA的含量與純度，反應(yīng)條件設(shè)置為預(yù)變性溫度95℃時間10min，變性溫度95℃時間15s，退火溫度60℃時間30s，延伸溫度72℃時間30s，循環(huán)40次，緩慢升溫的溫度60～95℃，產(chǎn)生溶解曲線。

所有樣本重復(fù)檢測3次，每次均設(shè)空白對照，以GAPDH作內(nèi)參基因。反應(yīng)結(jié)束后，使用ABI PRISM 7500型熒光定量PCR擴增儀檢測樣品中目標(biāo)基因的含量，以2-ΔΔCT作為目的基因的表達(dá)量，2-ΔΔCT表示處理組的目的基因相對于對照組原始模板濃度的倍數(shù)差異。

1.3 數(shù)據(jù)分析

作圖采用Origin 8.0軟件，統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，One-Way ANOVA進行處理和顯著性分析檢驗，在p＞0.05水平上差異不顯著；在p＜0.05水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 山桃稠李果實花色苷對HepG2細(xì)胞增殖抑制結(jié)果

山桃稠李果實花色苷作用HepG2細(xì)胞24、48、72h后，結(jié)果如表1所示。隨著花色苷濃度的升高以及作用時間的延長，對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用都逐漸增強，并呈濃度依賴與時間依賴。與對照組（未經(jīng)處理的細(xì)胞）相比差異顯著（p＜0.05），并且在同一時間點各濃度之間，同一濃度各時間點之間，山桃稠李果實花色苷對HepG2細(xì)胞的抑制率均有顯著差異（p＜0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8mg/m L山桃稠李果實花色苷處理HepG2細(xì)胞24、48、72h后，抑制率分別為30.79%±2.38%、47.77%±3.61%、54.11%±3.47%。

表1 MTT法檢測山桃稠李果實花色苷對HepG2細(xì)胞抑制率Table1 Inhibition of the anthocyanin extracted from Prunusmaackii on the proliferation of HepG2 cell tested by MIT

2.2 細(xì)胞內(nèi)GSH含量與GSH-ST、PI3K活性的測定結(jié)果

山桃稠李果實花色苷作用于HepG2細(xì)胞48h后，由表2可知，隨山桃稠李花色苷質(zhì)量濃度的增大，GSH的含量與對照組相比逐漸減少，且呈一定的量效關(guān)系，質(zhì)量濃度為0.05mg/m L山桃稠李花色苷與對照組相比差異顯著（p＜0.05），且當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.2mg/m L時，HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH的含量與對照組相比差異極顯著（p＜0.01）。細(xì)胞內(nèi)GSH-ST的活性出現(xiàn)下降趨勢，即隨著花色苷質(zhì)量濃度的增大，GSH-ST的活性逐漸降低：當(dāng)質(zhì)量濃度為0.05mg/m L時，山桃稠李與對照組的差異顯著（p＜0.05）；當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.2mg/m L時，與對照組的差異極顯著（p＜0.01）。而在檢測PI3K活性時發(fā)現(xiàn)處理組的OD值雖均大于對照組，但卻隨著三種果實花色苷質(zhì)量濃度的升高PI3K激酶的活性在逐漸降低，且各濃度與對照組比差異極顯著（p＜0.01），呈量效關(guān)系。

表2 山桃稠李花色苷對HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH含量及GSH-ST、PI3K激酶活性的影響Table2 Effectof anthocyanins extracted from Prunusmaackii on the contentof GSH and activity of GSH-ST、PI3K in the HepG2 cells

2.3 山桃稠李花色苷對Nrf2、Keap1、GSTP1的基因表達(dá)的影響

2.3.1 山桃稠李花色苷對GSTP1的基因表達(dá)的影響采用實時熒光定量RT-PCR法，深入探討稠李屬果實花色苷對GSTP1 mRNA在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)的影響。結(jié)果如圖1所示，山桃稠李果實花色苷作用于HepG2細(xì)胞48h后，GSTP1 mRNA的表達(dá)與對照組相比較均下調(diào)，且隨花色苷質(zhì)量濃度的增大而逐漸降低。與對照組相比較GSTP1 mRNA的表達(dá)水平極顯著降低（p＜0.01），說明山桃稠李果實花色苷影響了HepG2細(xì)胞中GSTP1的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而下調(diào)了HepG2細(xì)胞的抗氧化酶的表達(dá)。

2.3.2 山桃稠李花色苷對Nrf2的基因表達(dá)的影響

本實驗同時探討了稠李屬果實花色苷對PI3K-Keap1/ Nrf2通路的影響，檢測了山桃稠李果實花色苷作用HepG2細(xì)胞48h后，Nrf2 mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果見圖1，山桃稠李果實花色苷作用于HepG2細(xì)胞48h后，Nrf2 mRNA的表達(dá)均隨花色苷質(zhì)量濃度的增大而逐漸降低。與對照組相比較Nrf2 mRNA的表達(dá)水平極顯著降低（p＜0.01），說明由于花色苷的作用，PI3K激酶活力的下降，抗氧化系統(tǒng)受到破壞，影響了Nrf2與Keap1解離。

2.3.3 山桃稠李花色苷對Keap1的基因表達(dá)的影響

為進一步探究稠李屬果實花色苷對PI3K-Keap1/Nrf2通路的影響，檢測了山桃稠李果實花色苷作用HepG2細(xì)胞48h后，Keap1 mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果如圖1所示，在花色苷的質(zhì)量濃度為0.05mg/m L時，山桃稠李與對照組比較差異不顯著（p＞0.05）。在花色苷的質(zhì)量濃度增加到0.2mg/m L時，山桃稠李與對照組相比Nrf2 mRNA的表達(dá)水平均極顯著降低（p＜0.01）。并且，山桃稠李果實花色苷作用于HepG2細(xì)胞48h后，Keap1的基因表達(dá)均隨花色苷質(zhì)量濃度的增大而下調(diào)。說明由于花色苷的作用，使得Nrf2與Keap1的基因表達(dá)量均有所減少。

圖1 山桃稠李花色苷對Nrf2、Keap1、GSTP1的基因表達(dá)的影響Fig1 Effectof anthocyanins extracted from Prunusmaackii on Nrf2、Keap1、GSTP1 in genetic expression

3 結(jié)論與討論

GSTP1屬于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶系（GSTs），存在于胎盤和肺臟中，是重要的解毒酶。能夠保護正常細(xì)胞免有毒化合物的攻擊，分解代謝有毒物質(zhì)，若抑制GSTP1的活性則可增強DNA損傷的敏感性。GSTP1在HepG2等腫瘤細(xì)胞組織中易表達(dá)調(diào)控，具有緊密的關(guān)系且大量存在[8]。

在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)的一個重要的核轉(zhuǎn)錄因子為Nrf2，正常狀態(tài)下，與Keap1結(jié)合，同時被一些活性酶類降解，使細(xì)胞內(nèi)部處于動態(tài)平衡狀態(tài)。但當(dāng)Nrf2受外界因子及自身蛋白激酶（PKC）的影響而激活后，Nrf2與Keap1解離后進入細(xì)胞核內(nèi)，影響抗氧化酶的表達(dá)[9]。

由山桃果實花色苷對HepG2細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的影響實驗結(jié)果[10]可知，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶GSH-ST的活性隨著花色苷質(zhì)量濃度的增大而逐漸降低，細(xì)胞內(nèi)GSH的含量也隨著花色苷質(zhì)量濃度的增大而逐漸減少，即GSH-ST活性以及GSH的含量均出現(xiàn)下降的趨勢?；ㄉ湛梢餒epG2細(xì)胞內(nèi)PI3K激酶活性的降低，而PI3K途徑參與了Nrf2/Keap1激活及其基因表達(dá)的調(diào)控。所以當(dāng)PI3K激酶活性的降低時，Nrf2、Keap1的mRNA的表達(dá)受到抑制，使得Nrf2、Keap1的含量降低，Nrf2與抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合減小，導(dǎo)致抗氧化酶GSTP1mRNA的表達(dá)下調(diào)。而山桃稠李果實花色苷可通過降低胞內(nèi)抗氧化酶活性而增加HepG2細(xì)胞內(nèi)的ROS含量，ROS又會直接攻擊抗氧化酶，迫使細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激壓力增加導(dǎo)致細(xì)胞過氧化損傷，甚至凋亡。

近些年，Keap1/Nrf2信號通路成為抗氧化機制研究的熱點[11-14]。但機體的抗氧化機制依然存在許多無法解釋說明的問題，仍需要更深入的研究。

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