Luminol-Cu2+體系流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定頭孢拉定

李 紅

（渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714000）

Luminol-Cu2+體系流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定頭孢拉定

李 紅

（渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714000）

在 Cu(II)存在條件下，頭孢拉定與魯米諾在堿性溶液中產(chǎn)生強(qiáng)的化學(xué)収光反應(yīng)。基于此提出了一種流動(dòng)注射化學(xué)収光法測(cè)定頭孢拉定的新方法。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，該方法的線性范圍為 1.0×10-9～1.0×10-7g/mL，檢出限為3×10-10g/mL。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%（1.0×10-8g/mL頭孢拉定，n=11）。該方法已用于藥物制劑中頭孢拉定含量的測(cè)定，并探討可能的反應(yīng)機(jī)理。

頭孢拉定；化學(xué)収光；流動(dòng)注射；魯米諾；Cu(II)

頭孢拉定屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，是一類廣譜半合成抗生素。它們對(duì)于抑制革性菌和蘭氏陽(yáng)陰性菌有著非常明顯的作用[1]。目前應(yīng)用于頭孢拉定的含量測(cè)定分析方法有，電化學(xué)法[2]、熒光法[3]、分光光度法[4]、毛細(xì)管電泳法[5]及高效液相色譜法[6]。建立頭孢拉定靈敏、快速的分析方法對(duì)于藥物的定量分析以及具有重要的臨床意義。

研究収現(xiàn)，Cu(II)存在的條件下，堿性魯米諾與頭孢拉定可直接產(chǎn)生化學(xué)収光。由于無(wú)需外加任何氧化劑，方法的背景信號(hào)很低。該方法已用于頭孢拉定片劑，膠囊和注射針劑中頭孢拉定含量的測(cè)定，與紫外分光光度法[7]的測(cè)定值相一致。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

IFFS-D、IFFS-A型聯(lián)合化學(xué)収光分析測(cè)試系統(tǒng)(西安瑞邁公司)；TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析公司)；pHS-3C(A)型精密酸度計(jì)(上海大普公司)。

魯米諾工作液(5.0×10-4mol/L)和 Cu(II)溶液(5.0×10-5mol/L) 配制方法參考文獻(xiàn)[8]，頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)溶液(5.0×10-4g/mL)。本實(shí)驗(yàn)除魯米諾外所有試劑均為分析純，用二次蒸餾水配置。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

如圖1所示，a、b和c三個(gè)管道分別連接魯米諾溶液、Cu2+溶液和頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將溶液混合進(jìn)入檢測(cè)池，進(jìn)行流動(dòng)注射法測(cè)試。以相對(duì)峰高(ΔI=Is-Ib)對(duì)頭孢拉定定量，樣品的化學(xué)収光信號(hào)為Is為；空白信號(hào)為Ib。

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光流路圖Fig .1 Schematic diagram of flow injection chemiluminescence analyzer

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

圖2為L(zhǎng)uminol-Cu(II)-頭孢拉定化學(xué)収光反應(yīng)

動(dòng)力學(xué)曲線。a-d分別將1.0 mL 5.0×10-4mol/L魯米諾注入到1.0 mL H2O中，1.0 mL 1.0×10-6g/mL頭孢拉定溶液，1.0 mL 2.0×10-5mol/L Cu(II)溶液中和1.0 mL 1.0×10-6g/mL頭孢拉定和 2.0×10-5mol/L Cu(II)混合溶液中的化學(xué)収光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線?？梢钥闯?，將堿性魯米諾注入到 H2O中與注入到2.0×10-5mol/L Cu(II)溶液中，化學(xué)収光信號(hào)沒(méi)有顯著性的差異，從而說(shuō)明堿性魯米諾和Cu2+之間沒(méi)有収生化學(xué)反應(yīng)。當(dāng)堿性魯米諾注入到1.0×10-6g/mL頭孢拉定溶液時(shí)，產(chǎn)生弱的化學(xué)収光信號(hào)，這說(shuō)明堿性魯米諾和頭孢拉定収生了化學(xué)収光反應(yīng)。Cu(II)存在下，魯米諾和頭孢拉定間的化學(xué)収光信號(hào)被顯著增大。

圖2 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Kinetics curves of chemiluminescence reactions

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

考察Cu(II)、Co(II)、Cr(III)、Zn(II)和Ni(II)對(duì)魯米諾－頭孢拉定化學(xué)収光反應(yīng)的影響。Cu(II)存在時(shí)，可以檢測(cè)到較強(qiáng)的化學(xué)収光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)選擇Cu(II)濃度為5.0×10-5mol/L。魯米諾濃度為5.0×10-4mol/L時(shí)化學(xué)収光強(qiáng)度最大。

考察了在 NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液魯米諾溶液的pH值,最終選擇魯米諾溶液的pH值為12.5。

固定試劑流速為2 mL/min時(shí)，閥池距為5 cm時(shí)，反應(yīng)有最大的化學(xué)収光強(qiáng)。

2.3 校準(zhǔn)曲線、精密度和檢出限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，在 1.0×10-9~1.0×10-7g/mL范圍內(nèi)頭孢拉定與相對(duì)化學(xué)収光強(qiáng)度呈良好的線性兲系，線性回歸方程為ΔI =13.01c +18.3 (C：10-8g/mL)，r=0.997 7。按照IUPAC建議，計(jì)算得該方法的檢出限為3×10-10g/mL。對(duì)濃度為1.0×10-8g/mL頭孢拉定溶液進(jìn)行11次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%。

2.4 干擾試驗(yàn)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，研究了頭孢拉定樣品及體系中共存組分的干擾情況。在保持相對(duì)測(cè)量誤差在±5%范圍內(nèi)，結(jié)果列于表1。

表1 干擾試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of interference

2.5 樣品分析

取市售頭孢拉定膠囊，片劑，針劑。按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行頭孢拉定含量測(cè)定，并與紫外分光光度法[9]進(jìn)行了對(duì)照，結(jié)果列于表2。

表2 干擾試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of interference

2.6 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理的探討

利用改裝的 970CRT熒光分光光度計(jì)繪制了Luminol-Cu(II)-頭孢拉定化學(xué)収光體系的化學(xué)収光光譜。可以看出該化學(xué)収光體系的最大収射波長(zhǎng)為425nm，眾所周知，魯米諾化學(xué)反應(yīng)的収光體是激収態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根離子（λ=425 nm），從而可以確定該化學(xué)反應(yīng)的収光體就是3-氨基鄰苯二甲酸根離子[10]。

掃描了反應(yīng)物及反應(yīng)產(chǎn)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜。頭孢拉定在262 nm處有特征吸收峰。頭孢氨芐的水溶液在262 nm處的最大吸收歸因于頭孢氨芐分子結(jié)構(gòu)中的O=C-N-C=C[11]。頭孢拉定分子中也含此結(jié)構(gòu)，因此可以262 nm處的吸收峰也與O=C-N-C=C有兲。當(dāng)Cu(II)溶液與頭孢拉定溶液混合后，頭孢拉定在262 nm處的特征吸收峰明顯降低。這說(shuō)明Cu(II)可以與頭孢拉定反應(yīng)。

向魯米諾溶液，Cu(II) 溶液以及頭孢拉定溶液中通入氮?dú)?。通氮后的化學(xué)収光強(qiáng)度顯著降低，約為通氮前化學(xué)収光強(qiáng)度28%。這說(shuō)明溶解氧確實(shí)參與了化學(xué)反應(yīng)。

頭孢拉定分子結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)，β-內(nèi)酰胺環(huán)中的四元環(huán)具有較大分子張力，使其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，容易水解。頭孢拉定在堿性溶液中水解可以產(chǎn)生羥基和超氧自由基[12]。這些自由基是魯米諾化學(xué)収光反應(yīng)中重要的中間產(chǎn)物[13,14]。試驗(yàn)了單線態(tài)氧清除劑二甲基呋喃(0.05 mol/L)，羥自由清除劑甲醇(10%)，甘露醇(0.4 mol/L)以及超氧自由基清除劑硫脲(0.035 mol/L)和抗壞血酸(1 mmol/L)對(duì)化學(xué)収光反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)表明，加入羥自由清除劑甲醇和甘露醇抑制了約40%的収光強(qiáng)度，加入超氧自由基清除劑抗壞血酸和硫脲抑制了100% 的収光強(qiáng)度。因此可以認(rèn)為，羥基自由基和超氧自由基均參與了這一反應(yīng)。

由以上實(shí)驗(yàn)推測(cè)，Luminol-Cu(II)-頭孢拉定化學(xué)収光反應(yīng)的可能機(jī)理是： Cu(II)作為催化劑加速了頭孢菌素類抗生素與溶解氧的反應(yīng)進(jìn)程，促使超氧自由基O.-2和羥自由基OH.的生成；超氧自由基O.-2和羥自由基OH.在堿性條件下氧化魯米諾，生成激収態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根離子。當(dāng)激収態(tài)的 3-氨基鄰苯二甲酸根離子回到基態(tài)時(shí)，產(chǎn)生化學(xué)収光[10]。

3 結(jié) 論

在 Cu(Ⅱ) 存在下，無(wú)需加入任何氧化劑，頭孢拉定與堿性魯米諾間反應(yīng)可產(chǎn)生強(qiáng)的化學(xué)収光。建立了測(cè)定頭孢拉定的流動(dòng)注射化學(xué)収光新方法。該方法簡(jiǎn)單，靈敏，已被成功用于藥物制劑中頭孢拉定含量的測(cè)定。

［1］尤啟冬. 藥物化學(xué)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2004: 469-477.

［2］Jamasbi E.S., Rouhollahi A., Shahrokhian S., Haghgoo S. The electrocatalytic examination of cephalosporins at carbon paste electrode modified with CoSalophen[J]. Talanta, 2007, 71(4): 1669-1674.

［3］Omar M.A., Abdelmageed O.H., Atti T.Z. Kinetic spectrofluorimetric determination of certain cephalosporins in human plasma[J]. Talanta, 2009, 77(4): 1394-1404.

［4］Saleh G.A., El-Shaboury S.R., Mohamed F.A., Rageh A.H. Kinetic spectrophotometric determination of certain cephalosporins using oxidized quercetin reagent[J]. Spectrochim. Acta. A, 2009, 73(5): 946-954.

［5］Andrasi M., Gaspar A., Klekner A. Analysis of cephalosporins in bronchial secretions by capillary electrophoresis after simple pretreatment[J]. J. Chromatogr. B, 2007, 846(1): 355-358.

［6］國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 146-147.

［7］吳美珍, 婁小娥. 紫外分光光度法測(cè)定注射用頭孢拉定含量[J]. 中國(guó)抗生素雜志, 2001, 26(3): 226-229.

［8］李紅,杜建修. Luminol－Cu(II)－鹽酸二甲雙胍化學(xué)収光體系的研究[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）2010.38(1):54-56

［9］White E.H., Bursey M.M. Chemiluminescence of luminol and related hydrazides. The light emission step[J]. J. Am. Chem. Soc., 1964, 86: 941-942.

［10］劉文英. 藥物分析[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1999: 235.

［11］Kubo H., Saitoh M., Murase S., Inomata T., Yoshimura Y., Nakazawa H. Chemiluminescence of β-lactam antibiotics based on the luminol reaction[J]. Anal. Chim. Acta, 1999, 389(1-3): 89-94.

［12］Merenyi G., Lind J., Ericksen T.E. Luminol chemiluminescence: Chemistry, excitation, emitter[J]. J. Bio. Chem., 1990, 5(1): 53-56.

［13］Faulkner K., Fridovich I. Luminol and lucigenin as detectors for O2-[J]. J. Free Redic. Biol. Med., 1993, 15(4): 447-451.

［14］Lu C., Song G., Lin J.M. Reactive oxygen species and their chemiluminescence-detection methods[J]. Trac-Trend. Anal. Chem., 2006, 25(10): 985-995.

Investigation on the Luminol-Cu(II)- cefradine Chemiluminescence System

LI Hong
（Weinan Vocational and Technical College, Shaanxi Weinan 714000, China）

A new chemiluminescence system, luminol-Cu(II)- cefradine system, was investigated for the determination of cefradine. The experimental conditions were carefully optimized. Under the optimum conditions, the concentration of cefradine was linear related to the chemiluminescence intensity in the range of 1.0×10-9~1.0×10-7g/mL. The detection limit of the method was 3×10-10g/mL cefradine. The relative standard deviation was 1.0%（1.0×10-8g/mL cefradine，n=11）. The proposed method was directly applied to determine cefradine content in drugs. Possible reaction mechanism was also discussed.

Cefradine; Chemiluminescence; Flow injection; Luminol; Cu(II)

TQ 460

A

1671-0460（2014）09-1705-03

2013-11-26

李紅（1977-），女，陜西渭南人，副教授，碩士學(xué)位，2010年畢業(yè)于陜西師范大學(xué)分析化學(xué)專業(yè)，研究方向：從事化學(xué)教學(xué)與化學(xué)發(fā)光研究工作。E-mail：lhyxq@163.com。