反相高效液相色譜法測定刺梨中蘆丁和槲皮素的含量

王振偉，魏家紅（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南開封475000）

反相高效液相色譜法測定刺梨中蘆丁和槲皮素的含量

王振偉，魏家紅
（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南開封475000）

建立反相高效液相色譜法測定刺梨中蘆丁和槲皮素的含量。采用Waters Sunfire ODS C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.2%磷酸緩沖溶液（60:40），流速1.0 mL/min，檢測波長360 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，蘆丁和槲皮素良好分離，質(zhì)量濃度分別在2～100 μg/mL（R2=0.999 1)和1～100 μg/mL(R2=0.999 2)之間線性關(guān)系良好。平均加標(biāo)回收率分別為98.27%和99.15%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.98%和3.76%，重現(xiàn)性實驗RSD分別為蘆丁2.18%(n=5)，槲皮素1.76%(n=5)。測得刺梨中蘆丁和槲皮素的平均含量分別為7.070 mg/g和1.352 mg/g。RP-HPLC法簡便快捷、靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于刺梨中黃酮成分含量的檢測。

刺梨；黃酮；反相高效液相色譜；蘆?。婚纹に?/p>

刺梨（Rosa roxburghii）是薔薇科薔薇屬落葉灌木，又名繅絲花、文先果、送春歸，是集藥用、保健、食用、觀賞為一體的綠色特新水果，多分布于貴州、云南、河南等省。刺梨營養(yǎng)價值及食用價值極高，已有報道刺梨有提高免疫功能、延緩衰老、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、解毒鎮(zhèn)靜、降血脂等多種生物學(xué)作用[1-4]，近年來，有關(guān)刺梨果實中豐富的天然抗氧化物質(zhì)（黃酮類化合物及超氧化物歧化酶等）引起人們的廣泛關(guān)注[5-8]。

黃酮類化合物作為刺梨的主要生物活性成分之一，具有消除自由基、抗氧化、降血糖血脂、降血壓、抗腫瘤等作用，其中蘆丁和槲皮素是其主要活性成分，蘆丁具有降低毛細(xì)血管通透性、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗氧化及抑制醛糖還原酶等藥理活性，槲皮素具有降低血壓、增強毛細(xì)血管抵抗力、減少毛細(xì)血管脆性、降血脂、增加冠脈血流量等作用。因此研究刺梨中蘆丁和槲皮素含量的測定對于刺梨的質(zhì)量評價及資源的開發(fā)利用具有重要的意義。蘆丁和槲皮素的分析檢測方法已報道有分光光度法、催化動力學(xué)光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、熒光光譜法等[9-15]，其中最常用的是高效液相色譜法。為了綜合開發(fā)刺梨這種植物資源，本實驗用微波輔助提取刺梨中的總黃酮，并建立了反相高效液相色譜法同時測定蘆丁和槲皮素含量的方法，為刺梨制品質(zhì)量評價和資源利用提供可借鑒的簡便、可行、效率高、重復(fù)性好的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨：購自河南開封醫(yī)藥大廈。

蘆丁、槲皮素（標(biāo)準(zhǔn)品）：中國藥品生物制品檢定所；甲醇（色譜純）：天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；磷酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、無水乙醇等均為分析純：天津德恩化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

MDS-6微波消解萃取儀：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；Waters 1525高效液相色譜儀、2487紫外檢測器：美國沃特世公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HC-3018R冷凍離心機：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品溶液制備

干燥的刺梨果實粉碎過40目篩，準(zhǔn)確稱取粉末2.00 g，置于具塞三角燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇40 mL，微波功率400W輔助提取3min，離心分離得到上清液，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中加體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容作為待測液，進(jìn)樣前用0.45 μm濾膜過濾后作為供試品溶液[1，8]。

1.3.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取120℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg，全部置于25 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶解并定容至刻度，配成蘆丁和槲皮素質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的混合對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取此混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻過濾后備用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Waters sunfire ODS C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（60∶40）；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL，檢測波長以掃描為準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

我的畫院：畫院坐落在美麗的地方，有很多美麗的故事。如果想到其與宋代有著各種聯(lián)系，立刻讓人感到渺小，又讓人振奮，力爭創(chuàng)作出美麗的畫，以不負(fù)各方。

將蘆丁和槲皮素對照品溶液利用紫外分光光度計在波長200～600 nm范圍內(nèi)掃描，最大吸收峰對應(yīng)的波長即為檢測波長，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，在波長254 nm和360 nm處有兩個吸收峰，鑒于低波長處雜質(zhì)的干擾，選用360 nm作為檢測波長。

圖1 蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品紫外光譜圖Fig.1 Spectrogram of rutin and quercetin standard samples

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取1.3.2中配制好的質(zhì)量濃度為1μg/mL、2μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的混合對照品溶液各10μL進(jìn)樣，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對照品溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。蘆丁和槲皮素的線性回歸方程為Y=15 618X-11 087（R2=0.9991）和Y=2063.7X-923.8（R2=0.9992）。結(jié)果表明，蘆丁和槲皮素質(zhì)量濃度分別在2～100μg/mL和1～100μg/mL之間線性關(guān)系良好。

圖2 蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of rutin and quercetin

2.3 精密度實驗

為考察方法的穩(wěn)定性，在上述色譜條件下，精密吸取質(zhì)量濃度為50 μg/mL的混合對照品溶液10 μL進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄其峰面積分值，結(jié)果見表1。分別計算蘆丁、槲皮素的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值，其中蘆丁RSD為0.85%、槲皮素RSD為0.97%，結(jié)果表明，精密度良好。

表1 精密度實驗結(jié)果Table 1 Results of precision experiment

2.4 重現(xiàn)性實驗

表2 精密度實驗結(jié)果Table 2 Results of repeatability experiment

2.5 加標(biāo)回收率實驗

為考察方法的準(zhǔn)確度，精密移取5份已知含量的樣品供試液200 μL。分別精密加入100 μg/mL的混合對照品溶液50μL混合，精密吸取10μL。在上述色譜條件下進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。由表3可知，蘆丁平均回收率98.27%，RSD為2.98%，槲皮素平均回收率99.15%，RSD為3.76%表明實驗準(zhǔn)確性好。

表3 回收率實驗結(jié)果Table 3 Results of recovery experiment

2.6 樣品含量的測定

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)對照品(A)及樣品(B)色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and sample(B)

按照上述色譜條件，在波長360 nm條件下，分別精密吸取蘆丁和槲皮素混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL進(jìn)樣。其色譜圖結(jié)果見圖3。

由圖3可知，混合對照品中蘆丁和槲皮素分離良好，通過保留時間進(jìn)行定性，蘆丁標(biāo)樣的保留時間為2.406 min，槲皮素標(biāo)樣的保留時間是4.449 min，樣品分別在2.315 min和4.633 min中出現(xiàn)峰值。這兩種物質(zhì)在10 min內(nèi)能夠完全分離，互不干擾。除了蘆丁和槲皮素在刺梨黃酮提取物中存在，仍有很多未知成分亟待確定。隨后的工作中，需對刺梨中其他幾種黃酮成分進(jìn)行定性和定量分析，進(jìn)一步確定刺梨中黃酮的種類和含量。

準(zhǔn)確吸取樣品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測定蘆丁和槲皮素峰面積，平行3次，按照外標(biāo)法計算刺梨果實樣品中蘆丁和槲皮素的含量，結(jié)果見表4。

表4 刺梨樣品中蘆丁和槲皮素含量測定結(jié)果(n=3)Table 4 Determination results of rutin and quercetin in samples(n=3)

由表4可知，蘆丁和槲皮素是刺梨黃酮的主要成分，其中蘆丁的平均含量為7.070 mg/g，槲皮素的平均含量為1.352 mg/g，RSD值均＜3%。反向高效液相色譜法用于同時測定刺梨中蘆丁和槲皮素的含量，具有可行性。

3 結(jié)論

蘆丁和槲皮素是刺梨果實中主要的黃酮成分，可以作為刺梨黃酮測定的指標(biāo)。實驗采用微波提取刺梨果實中蘆丁和槲皮素，方法操作簡便、樣品前處理簡單、提取效率高。采用反向液相色譜法測定蘆丁和槲皮素含量，以甲醇-0.2%磷酸緩沖溶液（60∶40）作為流動相能夠保證蘆丁和槲皮素在10 min之內(nèi)出峰，分析速度快，分離效果好。實驗建立的同時測定刺梨中蘆丁和槲皮素含量的方法，簡化了分析過程，方法迅速、結(jié)果可靠，可為刺梨資源的合理開發(fā)利用和質(zhì)量評價提供理論依據(jù)。

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Determination of rutin and quercetin inRosa roxburghiiby RP-HPLC

WANG Zhenwei,WEI Jiahong (Yellow River Conservancy Technical Institute,Kaifeng 475000,China)

RP-HPLC method for quantitative determination of rutin and quercetin in Rosa roxburghii was established.Waters sunfire ODS C18column (4.6 mm×150 mm,5μm)was used as fixed phase,and methanol-0.2%phosphate buffer solution(60:40)was used as mobile phase running with a flow rate of 1.0 ml/min.The detection wavelength was 360 nm and the column temperature was 30℃.The results showed that rutin and quercetin were well separated by this method.The rutin and quercetin were in good linear relationship in concentration range of 2-100 μg/ml(R2=0.999 1)and 1-100 μg/ml(R2=0.999 2),respectively.The standard addition recovery was 98.27%and 99.15%,relative standard deviation was 2.98%and 3.76%, and the relative standard deviation of reproducibility experiment was 2.18%(n=5)and 1.76%(n=5),respectively.The average content of rutin and quercetin in Rosa roxburghii were 7.07 mg/g and 1.352 mg/g.The RP-HPLC method was simple,quick,accurate and sensitive,which can be used in rutin and quercetin content determination.

Rosa roxburghii;flavonoids;RP-HPLC;rutin;quercetin

O657.72

A

0254-5071（2014）07-0109-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.025

2014-05-12

河南省教育廳自然科學(xué)基金項目（12B530003）

王振偉（1980-），男，講師，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物提取分離及活性研究。