外源性天然色素?fù)絺喂坪惋嬃翔b別檢測方法的研究

劉浩，趙廣西*，葛娜，李峰，楊帛，杜偉

（1.國家葡萄、葡萄酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（秦皇島），河北秦皇島066000；2.秦皇島出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北秦皇島066000；3.南通食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇南通226000）

外源性天然色素?fù)絺喂坪惋嬃翔b別檢測方法的研究

劉浩1，趙廣西1*，葛娜2，李峰3，楊帛1，杜偉1

（1.國家葡萄、葡萄酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（秦皇島），河北秦皇島066000；2.秦皇島出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北秦皇島066000；3.南通食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇南通226000）

研究了5種天然色素-越橘紅、紅米紅、黑加侖紅、蘿卜紅、葡萄皮紅的高效液相色譜檢測法，樣品處理后，甲醇-乙腈-甲酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在檢測波長為515 nm條件下對5種目標(biāo)物同時(shí)進(jìn)行檢測。試驗(yàn)表明，5種色素檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.7%～7.4%，回收率為74.1%～94.7%，檢出限為5.6～7.5 mg/L。由此可知，本研究建立的天然色素檢測方法簡單快速，精確可靠，重復(fù)性好。

摻偽；鑒別；檢測；天然色素

食品的安全性已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，人們對待食品不再只停留在色、香、味上，更在于其安全、營養(yǎng)。天然色素不僅可以改善食品性狀，增加食欲，還對人體有多種有益作用，因此開發(fā)安全可靠的天然食用色素對保障人類健康和促進(jìn)食品工業(yè)等的發(fā)展具有十分重要的意義，已受到世界各國的高度關(guān)注。近年來天然食用色素的使用量呈快速增長的趨勢，其的安全使用勢必成為食品安全領(lǐng)域的新熱點(diǎn)[1-3]。

天然色素的大量使用有助于產(chǎn)品質(zhì)量的提升，但由于檢測方法的缺乏，使得部分產(chǎn)品借機(jī)以次充好、以假充真，擾亂了正常的市場秩序。越橘紅、紅米紅、黑加侖紅、蘿卜紅、葡萄皮紅5種天然色素產(chǎn)量較大[4-5]，在果酒和飲料中應(yīng)用廣泛但研究較少，尤其缺乏對樣品中摻雜使用的具體檢測方法，特別是紅米紅在葡萄酒中被大量應(yīng)用，對葡萄酒市場的正常秩序造成了很大沖擊，而近年來葡萄酒中葡萄皮紅色素的使用也在迅速發(fā)展[6]。研究這些色素的使用具有很強(qiáng)的代表意義。由于幾種色素都是從植物中提取出來，其中含有較多成分，因此研究針對主要呈色物質(zhì)進(jìn)行。根據(jù)文獻(xiàn)確定這5種色素的主要呈色物質(zhì)分別為紅米紅（矢車菊素-3-葡萄糖苷），越橘紅（矢車菊-3-半乳糖苷），黑加侖紅（飛燕草素-3-蕓香糖苷），蘿卜紅（天竺葵-O-葡萄糖苷），葡萄皮紅（錦葵色素-3-葡萄糖苷）[7-11]。

目前天然色素檢測方法主要有層析法[12]、分光光度法[13]、液相色譜法[14-18]、高效逆流色譜法[19]、液質(zhì)聯(lián)用法[20-23]等。其中層析法、分光光度法很難實(shí)現(xiàn)對色素中不同組分的檢測，應(yīng)用有較大局限。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析花色苷所需流動(dòng)相pH較低，容易抑制質(zhì)譜的離子化，影響分析。高效逆流色譜法應(yīng)用較少，無顯著優(yōu)點(diǎn)。本研究利用高效液相色譜儀同時(shí)檢測果酒和飲料中5種天然色素，得到的方法快捷、簡便、準(zhǔn)確，可廣泛應(yīng)用于飲料和果酒中天然色素的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘿卜紅色素：北京金曄生物技術(shù)有限公司；越橘紅色素：佛山市南海怡康天然制品有限公司；紅米紅色素：晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司；葡萄皮紅色素：廣州市中旺生物科技有限公司：黑加侖紅：河南明瑞食品添加劑有限公司。果酒是葡萄酒和飲料同為秦皇島本地市售產(chǎn)品。

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：北京迪馬科技有限公司；三氟乙酸、氨水、甲酸（均為分析純）：天津市化學(xué)試劑三廠。矢車菊-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-葡萄糖苷、飛燕草素-3-蕓香糖苷、天竺葵-O-葡萄糖苷：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）：美國安捷倫公司；HHS-21-8型智能數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋：NOKI諾基儀器有限公司；IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA集團(tuán)公司。Cleanert PCX（6 mL/500 mg）固相萃取小柱：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18（2.1 mm×250 mm，5 μm）；柱溫箱溫度：30℃；流動(dòng)相：水/甲酸（95∶5）（A）和甲醇/乙腈/水/甲酸（22.5∶22.5∶45∶5）（B），梯度洗脫，洗脫程序見表1。流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測器為紫外檢測器，檢測波長515 nm。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.3.2 樣品處理

將樣品溫?zé)幔瑪嚢杈鶆蚝?，? mL經(jīng)過2%三氟乙酸12 mL活化后的Cleanert PCX小柱，酸化甲醇12 mL清洗雜質(zhì)，5%氨水/甲醇（40∶60）6 mL洗脫，收集洗脫液加甲酸調(diào)節(jié)pH值至2后旋蒸定容至5 mL，用0.45 μm的超濾膜過濾提取液，供分析用。

1.3.3 標(biāo)品處理

取適量標(biāo)品用超純水溶解后定容，配制成10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4℃冰箱中備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限

圖1顯示了果汁樣品5種色素的出峰順序，依次分別為1：飛燕草素-3-蕓香糖苷；2：矢車菊-3-半乳糖苷；3：錦葵色素-3-葡萄糖苷；4：矢車菊素-3-葡萄糖苷；5：天竺葵-O-葡萄糖苷。

圖1 樣品中5種色素高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of 5 pigments in samples

將一系列不同濃度的色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3試驗(yàn)方法進(jìn)行測定，以峰面積對質(zhì)量濃度繪制工作曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，以3倍信噪比確定檢出限，結(jié)果見表2。

表2 色素的回歸分析結(jié)果和檢出限Table 2 Regression analysis results and detection limit of 5 pigments

由表2可知，5種色素質(zhì)量濃度在10～500 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，而且方法的分離度好，檢出限低。試驗(yàn)過程105 min時(shí)間較長，但樣品往往基質(zhì)復(fù)雜，花色苷類型多樣，長時(shí)間的試驗(yàn)保證花色苷的有效分離。

2.2 精密度和加標(biāo)回收率試驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，稱取7份葡萄酒樣品，其中一份作為空白，另外6份樣品分別加入一定質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行提取凈化，分別進(jìn)樣，加標(biāo)回收，計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），3個(gè)添加水平的平均回收率范圍和精密度結(jié)果見表3。

表3 精密度及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision and recovery rate of 5 pigments

由表3可知，5種紅色素精密度試驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.7%～7.4%，加標(biāo)回收率為74.1%～94.7%，表明該方法精密度好，準(zhǔn)確度高。

2.3 樣品中5種色素的檢測

圖2是對當(dāng)?shù)禺a(chǎn)紅葡萄酒中樣品矢車菊素-3-葡萄糖苷高效液相色譜檢測圖，檢測中發(fā)現(xiàn)部分葡萄酒中含有一定量的矢車菊素-3-葡萄糖苷，含量范圍在13～30 mg/kg。

圖2 葡萄酒中矢車菊素-3-葡萄糖苷高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of cornflower-3-glucoside in grape wine

試驗(yàn)測定了果汁飲料20份，葡萄酒10份共30份樣品，其中越橘紅的檢出率為33%，平均質(zhì)量濃度為46mg/L；紅米紅的檢出率為60%，平均質(zhì)量濃度為108 mg/L；黑加侖紅的檢出率為40%，平均質(zhì)量濃度為65 mg/L；蘿卜紅的檢出率為33%，平均質(zhì)量濃度為58 mg/L；葡萄皮紅的檢出率為20%，平均質(zhì)量濃度為25 mg/L。

3 結(jié)論

試驗(yàn)選擇越橘紅、紅米紅、黑加侖紅、蘿卜紅、葡萄皮紅5種色素作為研究對象，研究建立了應(yīng)用高相液相儀檢測果酒和飲料中天然色素的方法，通過對樣品前處理方法及色譜柱、流動(dòng)相等色譜條件的優(yōu)化和改進(jìn)，Cleanert PCX固相萃取小柱凈化和富集天然色素，用Phenomenex C18柱，以水/甲酸（95∶5）（A）和甲醇/乙腈/水/甲酸（22.5∶22.5∶45∶5）（B）為流動(dòng)相在波長515 nm處進(jìn)行測定，同時(shí)檢測了越橘紅、紅米紅、黑加侖紅、蘿卜紅、葡萄皮紅5種色素。

結(jié)果表明，在色素質(zhì)量濃度為10～500mg/L時(shí)線性關(guān)系良好。對樣品進(jìn)行的精密度及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，5種色素檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.7%～7.4%，回收率為74.1%～94.7%，檢出限為5.6～7.5 mg/L。由此可知，本研究建立的天然色素檢測方法簡單快速，精確可靠，重復(fù)性好。

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Determination of exogenous natural pigment in adulterating fruit wine and drink

LIU Hao1,ZHAO Guangxi1*,GE Na2,LI Feng3,YANG Bo1,DU Wei1

(1.National Center of Supervision&Inspection on Grape and Wine Quality,Qinhuangdao 066000,China;2.Qinhuangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of China Inspection and Quarantine Technique Centre,Qinhuangdao 066000,China; 3.Nantong Food Vocational Technology College,Nantong 226000,China)

A simple and accurate method for the determination of 5 natural pigments in adulterated food was developed.In order to determine these constituents by RP-HPLC,cowberry red,red kermel color,black currant red,radish red and grape-skin red were gradient eluted using methanol-acetonitrile-formic acid as mobile phase.Samples were detected simultaneously at the wavelength was 515 nm.Result showed that the relative standard deviation,average recovery and detection limit were 5.7%-7.4%,74.1%-94.7%,5.6-7.5mg/L,respectively.The HPLC method to simultaneously determine five natural pigments was simple,fast,accurate,and reliable with good repeatability.

adulteration;distinguishing;detection;natural pigment

O657.7

A

0254-5071（2014）07-0105-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.024

2014-04-25

河北省技術(shù)監(jiān)督局項(xiàng)目（2011ZB16）

劉浩（1977-），男，高級工程師，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。

*通訊作者：趙廣西（1979-），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。