畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)甲醇蛋白工藝條件的優(yōu)化

茍萬曉，衛(wèi)紅偉，胡元森，王樂*

（1.義馬煤業(yè)集團煤生化高科技工程有限公司，河南義馬472300；2.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)甲醇蛋白工藝條件的優(yōu)化

茍萬曉1，衛(wèi)紅偉2，胡元森2，王樂2*

（1.義馬煤業(yè)集團煤生化高科技工程有限公司，河南義馬472300；2.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

利用實驗室選育馴化出的高產(chǎn)甲醇蛋白的畢赤酵母（Pichia pastorisYM-SCP02）作為甲醇蛋白生產(chǎn)菌種，對甲醇蛋白發(fā)酵生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵因素進行較為全面的考察和優(yōu)化，初步確定了搖瓶水平發(fā)酵各因素的最優(yōu)條件為接種量8%，分段發(fā)酵溫度采用0～36 h，30℃，36～64 h，28℃，初始pH值為5.0，初始甲醇添加量為1.2%，裝液量為50 mL/250 mL搖瓶，轉(zhuǎn)速為200 r/min。在此條件下，得到的甲醇蛋白最高產(chǎn)量（細(xì)胞干質(zhì)量）為19.3 g/L。

甲醇蛋白；畢赤酵母；發(fā)酵；工藝條件；優(yōu)化

以工業(yè)甲醇為原料生產(chǎn)出來的甲醇蛋白被稱之為第二代單細(xì)胞蛋白，與天然蛋白相比，其粗蛋白含量比魚粉和大豆都要高，且含有豐富的必需氨基酸、礦物質(zhì)和維生素，可以部分替代魚粉、大豆、骨粉、肉類以及脫脂奶粉[1-2]。而且甲醇蛋白的原料易得、資源相對豐富、不占耕地、不依賴海洋、生產(chǎn)不受氣候條件影響、生產(chǎn)速度快[3]。甲醇蛋白生產(chǎn)成本低，以甲醇蛋白代替?zhèn)鹘y(tǒng)的魚粉和豆類等蛋白，無疑會降低飼料成本，提高飼養(yǎng)效率，加速我國飼料工業(yè)的發(fā)展[4-6]。同時，利用現(xiàn)代微生物技術(shù)開發(fā)無糧食型，高效能生產(chǎn)蛋白質(zhì)營養(yǎng)飼料是有力推進我國飼料工業(yè)發(fā)展的必要手段，是解決目前蛋白飼料短缺，依賴進口這一矛盾的有效途徑[7-9]。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達(dá)外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，具有遺傳穩(wěn)定、表達(dá)水平高、蛋白可翻譯后加工、產(chǎn)物可分泌、可高密度發(fā)酵等許多優(yōu)點，應(yīng)用十分廣泛[6]。畢赤酵母具有強烈的好氧生長偏好性，可進行細(xì)胞高密度培養(yǎng)，且由于自身分泌到培養(yǎng)基中的蛋白很少，因此純化方便，利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[10]。不同外源蛋白要求不同的發(fā)酵工藝條件，可從發(fā)酵培養(yǎng)基、補料調(diào)節(jié)、溶解氧濃度、菌體密度等多個方面進行優(yōu)化[11]。通過上述方面的調(diào)控可使外源蛋白表達(dá)量提高10%～900%[2]。因此對發(fā)酵工藝的優(yōu)化調(diào)控是提高畢赤酵母外源蛋白表達(dá)量的重要手段之一[12]。

本實驗選取畢赤酵母作為發(fā)酵生產(chǎn)甲醇蛋白的原始菌株，經(jīng)過誘變和馴化選育得到了具有適應(yīng)實驗室所用底物的甲醇蛋白高產(chǎn)高效菌株。采用單因素試驗，考察和分析發(fā)酵過程中的培養(yǎng)基、接種量、溫度、pH值、裝液量、轉(zhuǎn)速等關(guān)鍵因素對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響，旨在系統(tǒng)優(yōu)化Pichia pastorisYM-SCP02菌株以甲醇為底物發(fā)酵生產(chǎn)甲醇蛋白的生產(chǎn)工藝。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）原始菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.2477，經(jīng)過本課題組誘變與馴化選育后獲得了優(yōu)良菌株P(guān)ichia pastorisYM-SCP02。該菌株能利用常規(guī)的工業(yè)甲醇生產(chǎn)菌體蛋白，與原始菌株相比，生長速率更快，甲醇產(chǎn)率更高。本菌株于4℃斜面試管中保存常用，-80℃甘油管中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

菌種的保存采用常規(guī)的酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extractpeptone dextrose，YEPD）復(fù)合培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%、葡萄糖2%，瓊脂粉2%。

種子擴大培養(yǎng)：

（1）種子培養(yǎng)基采用YEPD復(fù)合培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%、葡萄糖2%，甲醇0.5%，KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O 0.05%。

（2）種子發(fā)酵培養(yǎng)條件：250 mL搖瓶中裝50 mL培養(yǎng)基，生長溫度為30℃，培養(yǎng)基初始pH值為5.0，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時間24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

選擇培養(yǎng)甲醇蛋白生產(chǎn)菌常用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基BSM培養(yǎng)基，用于生產(chǎn)甲醇蛋白，初始甲醇的體積分?jǐn)?shù)為1.0%，每隔20 h，補加甲醇0.5%。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：85%磷酸26.7 mL/L，二水硫酸鈣0. 93 g/L，硫酸鉀18.3 g/L，七水硫酸鎂14.9 g/L，氫氧化鉀4. 13 g/L，甘油40 g/L，微量元素溶液8 mL/L。

微量元素溶液配方：五水硫酸銅6g/L，碘化鉀0.088g/L，一水硫酸錳3 g/L，二水鉬酸鈉0.2 g/L，硼酸0.02 g/L，六水合氯化鈷0.5 g/L，氯化鋅20 g/L，七水合硫酸亞鐵65 g/L，生物素0.8 g/L，濃硫酸5 mL/L。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)條件：在研究培養(yǎng)基各組分用量及單一因素發(fā)酵條件對甲醇蛋白產(chǎn)量影響時，發(fā)酵培養(yǎng)條件為250 mL搖瓶中裝50 mL培養(yǎng)基，生長溫度為30℃，培養(yǎng)基初始pH值為5.0，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時間64 h。

1.1.3化學(xué)試劑

實驗所用的化學(xué)試劑純度均為市售分析純。

1.2儀器與設(shè)備

DGG-101-1電熱鼓風(fēng)干燥箱、HP-9052恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ADVENTURER電子天平：奧豪斯儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；TDL-40B離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；T-6可見-紫外分光光度計：北京新世紀(jì)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；BH-2 Olympus顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Agilent1200高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.3方法

1.3.1發(fā)酵液菌濃度的測定

將剛發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液搖勻吸取2 mL，用去離子水定容至50 mL。用分光光度計測定其在波長630 nm處的吸光度值。

1.3.2發(fā)酵液pH值的測定

發(fā)酵開始后每隔2 h，采用無菌操作方法，利用精密pH計（精度為0.01），快速測定發(fā)酵液的pH值。

1.3.3濕菌質(zhì)量與干菌質(zhì)量的測定

（1）菌體干質(zhì)量測定/甲醇蛋白含量

取50mL菌懸液，于稱質(zhì)量后的干燥離心管內(nèi)，4500r/min離心10 min，棄上清，固形物（菌體）用去離子水洗滌-離心2遍后，于55℃烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量，為甲醇蛋白產(chǎn)量。

（2）菌體濕質(zhì)量測定

取50mL菌體懸液于稱質(zhì)量后的干燥離心管內(nèi)，4500r/min離心10 min，棄上清，固形物（菌體）用去離子水洗滌-離心2遍后，直接稱質(zhì)量。

1.3.4甲醇含量的檢測

甲醇含量的測定，參照GB/T 9722—2006《化學(xué)試劑氣相色譜法通則》。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1磷酸和甘油對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響

圖1　培養(yǎng)基中磷酸的量對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of phosphoric acid addition in medium on methanol protein yield

由圖1可知，當(dāng)磷酸的用量為原始量時（質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%），53.4 mL/L），甲醇蛋白的產(chǎn)量相對于磷酸的用量為原始量1/2（26.7 mL/L）的75.4%，說明培養(yǎng)基中過高的磷酸濃度不利于甲醇蛋白生產(chǎn)菌的最大化生長。因此，最適的磷酸用量為原始量1/2，即26.7 mL/L時，甲醇蛋白產(chǎn)量最高，為18.4 g/L。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基配方中的甘油的原始含量為40 g/L。由圖2可知，甘油的用量為原始配方中1倍時，即甘油添加量為40 g/L時，甲醇蛋白產(chǎn)量能達(dá)到最高值，此時的甲醇蛋白含量為18.7g/L，這可能是由于甘油的用量較大時可使碳源量增大，在前期使得菌體增殖較快較多，有利于后期酵母細(xì)胞對甲醇的利用，提高了甲醇利用速率；甘油的用量較小時不能滿足甲醇蛋白生產(chǎn)菌的最快生長時對碳源的需求，同時發(fā)酵液中菌體量不夠，甲醇誘導(dǎo)生長時間較長，菌體容易出現(xiàn)中毒現(xiàn)象[13]。因此，培養(yǎng)基中最適的甘油質(zhì)量濃度為40 g/L。

圖2　培養(yǎng)基中甘油用量對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of glycerinum addition in medium on methanol protein yield

2.1.2不同生物素添加量對發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白影響

考察不同生物素添加量（生物素的濃度為5‰，添加量為0.4～2.0 mL）對發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白影響，結(jié)果見圖3。

圖3　培養(yǎng)基中生物素用量對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of biotin addition in medium on methanol protein yield

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基配方中生物素的原始添加量為6mg/L。由圖3可知，當(dāng)生物素的用量為原始配方時，即生物素添加量為6 mg/L時，發(fā)酵64 h后甲醇蛋白產(chǎn)量能達(dá)到最高值，此時甲醇蛋白的產(chǎn)量為18.3 g/L，表明生物素的添加量為6 mg/L即能滿足菌體發(fā)酵生產(chǎn)所需。增加生物素的添加量至6 mg/L，甲醇蛋白的產(chǎn)量持續(xù)增加，但隨著生物素添加量的繼續(xù)增加，甲醇蛋白的產(chǎn)量基本保持不變甚至略有降低。

2.1.3微量元素溶液的添加量對發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白影響

微量元素溶液的添加量（0.4～1.0 mL/100 mL培養(yǎng)基）對發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白有一定的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　微量元素溶液的添加量對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of microelement solution addition on methanol protein yield

由圖4可知，隨著微量元素溶液的添加量小幅度增加，甲醇蛋白產(chǎn)量有明顯增長。發(fā)酵64 h后，添加0.8 mL微量元素溶液/100mL培養(yǎng)基中甲醇蛋白產(chǎn)量值達(dá)到最高值，而添加0.4 mL微量元素溶液/100 mL培養(yǎng)基中的甲醇蛋白產(chǎn)量明顯低于0.8 mL/100 mL。因此最適的微量元素溶液添加量為0.8mL/100mL培養(yǎng)基，此時甲醇蛋白的產(chǎn)量為18.8g/L。

2.2發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1接種量對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響

不同接種量（4%～14%）對甲醇蛋白的產(chǎn)量有一定影響，結(jié)果見圖5。

圖5　接種量對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of inoculum on methanol protein yield

由圖5可知，當(dāng)接種量為8%（接種量與培養(yǎng)基體積比），甲醇蛋白產(chǎn)量最高。接種量＞10%時，由于菌體在初期對底物和營養(yǎng)成分的消耗過大，甲醇蛋白產(chǎn)量得不到明顯提高，同時還會導(dǎo)致發(fā)酵液稀釋嚴(yán)重，不利于甲醇蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)[1]。當(dāng)接種量＜5%時，甲醇蛋白的產(chǎn)量隨接種量的減少下降明顯，原因是甲醇濃度過高會對菌體產(chǎn)生一定抑制作用，接種量過低導(dǎo)致單位菌體受到甲醇的抑制作用增加，細(xì)胞生長的停滯期較長。同時，由于接種量過小，細(xì)胞的初始濃度過低，菌體進入發(fā)酵液后不能形成良好的種群優(yōu)勢，抵抗微生物侵?jǐn)_的能力顯著下降，細(xì)胞的正常生長和代謝也會受到影響，造成甲醇蛋白的產(chǎn)量降低[6]。綜上可知，最佳的接種量為8%。

2.2.2培養(yǎng)溫度對的發(fā)酵結(jié)果的影響

不同培養(yǎng)溫度（0～36 h，30℃，36～64 h，28℃和0～36 h， 28℃，36～64 h，30℃）對發(fā)酵結(jié)果的有一定影響，結(jié)果見表1。

表1　培養(yǎng)溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響Table 1 Effect of temperature on fermentation result

適宜的發(fā)酵培養(yǎng)溫度對細(xì)胞的正常生長和代謝十分必要[3]。溫度對畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)物的活性、發(fā)酵液的物理性質(zhì)及生物合成方向等都有影響[8]。由表1可知，28～32℃是畢赤酵母（Pichia pastorisYM-SCP02）發(fā)酵生產(chǎn)甲醇蛋白的較適宜溫度范圍。溫度為32℃時，發(fā)酵結(jié)束后甲醇剩余量最低，但＜30℃細(xì)胞量的結(jié)果，說明較高的溫度利于菌體對甲醇的代謝，但并不利于細(xì)胞量的積累。溫度＜30℃時，隨著溫度的繼續(xù)降低，發(fā)酵結(jié)束后甲醇的殘留逐漸增高，細(xì)胞量呈現(xiàn)平穩(wěn)上升，然后快速下降的趨勢。表明在一定的溫度范圍內(nèi)，低溫誘導(dǎo)對分泌蛋白表達(dá)更有利，但隨著溫度的進一步降低，生化反應(yīng)活性也隨之降低，最終導(dǎo)致甲醇蛋白的產(chǎn)量出現(xiàn)降低的結(jié)果[12]?？紤]到較高溫度有利于菌體在初期快速生長，而較低的溫度更適宜的甲醇蛋白的積累，因此采用0～36 h，30℃，36～64 h，28℃為最優(yōu)的培養(yǎng)溫度。發(fā)酵結(jié)束后甲醇蛋白的產(chǎn)量為19.2 g/L。

2.3初始pH值對發(fā)酵結(jié)果的影響

pH值是發(fā)酵調(diào)控中的關(guān)鍵參數(shù)，對微生物代謝的影響十分重要。采用滴加少許稀鹽酸或氫氧化鈉溶液對培養(yǎng)基初始pH值進行調(diào)節(jié)，考察不同初始pH值（3.0～8.0）對發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖6。

圖6　初始pH值對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of initial pH value on methanol protein yield

由圖6可知，發(fā)酵最適初始pH值為4.5～5.5，說明弱酸性的發(fā)酵環(huán)境更適宜菌體的生長和甲醇蛋白的積累，此時甲醇蛋白產(chǎn)量為19.1 g/L。當(dāng)pH＜4.0時，甲醇蛋白的產(chǎn)量有所下降，可能是由于過低的pH值會影響膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性，進而影響對物質(zhì)的吸收能力[2]。當(dāng)pH值＞7.0時，隨著pH值的增加，甲醇蛋白的產(chǎn)量顯著下降，原因可能與過高的pH值會抑制菌體中某些酶的活性，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝，甚至造成菌體的新陳代謝受阻[10]。因此，選擇最適的發(fā)酵初始pH值為5.0。

2.4甲醇初始添加量對發(fā)酵結(jié)果的影響

考察不同甲醇初始添加量（0.4%～2.0%）對發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖7。

圖7　甲醇初始添加量對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of initial methanol addition on methanol protein yield

由圖7可知，不同甲醇添加量對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響不同，隨著甲醇初始添加量（甲醇添加量與培養(yǎng)基質(zhì)量比）逐步升高，甲醇蛋白產(chǎn)量逐漸增加之后又呈逐漸降低的趨勢，反映出畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母，可以在以甲醇為碳源和能源的培養(yǎng)基中生長，但過高甲醇添加量抑制細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的表達(dá)[14]。實驗發(fā)現(xiàn)甲醇添加量為1.2%時，甲醇蛋白的產(chǎn)量最大，高達(dá)19.0 g/L，而＞1.2%時，隨甲醇的添加量增加，甲醇蛋白的產(chǎn)量降低，表明較高甲醇添加量抑制菌體生長，因此最適的甲醇初始添加量為1.2%。

2.5裝液量和轉(zhuǎn)速對發(fā)酵結(jié)果的影響

在搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min條件下，考察不同的裝液量（30～100 mL/250 mL搖瓶）對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，裝液量＞80 mL/250 mL時，發(fā)酵結(jié)束后甲醇蛋白的產(chǎn)量＜16 g/L，隨著裝液量的進一步提高，甲醇蛋白產(chǎn)量下降的趨勢更加明顯。當(dāng)裝液量＜80mL/250mL時，甲醇蛋白的產(chǎn)量隨著裝液量的降低呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，在裝液量為50mL/250mL時達(dá)到最高產(chǎn)量18.9g/L。原因是畢赤酵母是好氧微生物，溶解氧濃度對菌體的生長和產(chǎn)物生成的影響很大，較高的溶氧條件是提高發(fā)酵效率和甲醇蛋白產(chǎn)量的重要保證[11]。但考慮到過低的裝液量會帶來成本的增加等不利因素，因此最適的裝液量為50mL/250mL。

圖8　裝液量對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of liquid volume on methanol protein yield

圖9　轉(zhuǎn)速對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of rotate speed on methanol protein yield

在裝液量為50 mL/250 mL條件下，考察不同轉(zhuǎn)速（120～280 r/min）對甲醇蛋白產(chǎn)量的影響，如圖9所示。轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)是改變發(fā)酵過程中溶解氧的重要方面，較高的轉(zhuǎn)速會提高氧的體積傳遞系數(shù)，增加發(fā)酵液中氧的供給[15]。因此選擇合適的搖瓶轉(zhuǎn)速，對提高畢赤酵母好氧發(fā)酵生產(chǎn)甲醇蛋白的產(chǎn)率十分重要。由圖9可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速＜180 r/min時，由于發(fā)酵過程中的轉(zhuǎn)速過低，溶氧濃度不能滿足細(xì)胞快速生長時對氧氣的需求，抑制的菌體的生長和繁殖，細(xì)胞增殖緩慢，甲醇蛋白產(chǎn)量較低。但若轉(zhuǎn)速＞250 r/min，發(fā)酵過程中的溶氧會過高，會發(fā)生細(xì)胞氧中毒的現(xiàn)象，此外過高的轉(zhuǎn)速細(xì)胞所承受的剪切力過大，甚至?xí)觿〖?xì)胞死亡速率，甲醇蛋白產(chǎn)量迅速降低。因此，最適的轉(zhuǎn)速為200 r/min，此時的溶氧保持在有利于外源蛋白高效表達(dá)的范圍，也可以降低底物和有害廢物的抑制作用，細(xì)胞生長繁殖狀態(tài)良好，甲醇蛋白的產(chǎn)量最高，發(fā)酵結(jié)束后甲醇蛋白的產(chǎn)量高達(dá)19.0 g/L。

3　結(jié)論

對畢赤酵母（Pichia pastorisYM-SCP02）發(fā)酵生產(chǎn)甲醇蛋白工藝條件進行了優(yōu)化，最適的發(fā)酵培養(yǎng)條件為接種量8%、發(fā)酵溫度采用0～36h，30℃，36～64h，28℃、初始pH值為5.0、初始甲醇添加量為1.2%，裝液量為50 mL/250 mL搖瓶、轉(zhuǎn)速為200 r/min，最終得到的甲醇蛋白最高產(chǎn)量（細(xì)胞干質(zhì)量）為19.3 g/L。

[1]DALY R,HEARN M T W.Express ion of heterologous proteins inPichia pastoris:a useful experimental tool in protein engineering and production[J].J Mol Recognit,2005,18(2):119-138.

[2]林俊涵.畢赤酵母高密度發(fā)酵工藝的研究[J].中國生物工程雜志，2009，29（5）：120-125.

[3]CELIK E,CALIK P,OLIVER S G.Metabolic flux analysis for recombinant protein production byPichia pastorisusing dual carbon sources:effects of methanol feeding rate[J].Biotechnol Bioeng,2010,105(2):317-329.

[4]高玉榮，劉洋，李大鵬，等.大豆糖蜜高產(chǎn)單細(xì)胞蛋白菌株的篩選及其生長條件[J].中國釀造，2010，29（8）：33-36.

[5]王定昌，徐達(dá)伍.飼料級酵母單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)技術(shù)[J].糧油食品科技，2009，17（1）：7-9.

[6]彭毅，步威，康良儀.甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)[J].生物技術(shù)通報，2000，82（1）：38-41.

[7]史先振.現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展[J].中國釀造，2005，24（12）：1-4.

[8]李洪淼，王紅寧，許欽坤.畢赤酵母高密度發(fā)酵研究進展[J].生物技術(shù)通訊，2005，16（2）：210-212.

[9]周祥山，范衛(wèi)民，張元興.不同甲醇流加策略對重組畢赤酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)水蛭素的影響[J].生物工程學(xué)報，2002，18（3）：348-351.

[10]CHAROENRAT T,KETUDAT M,STENDAHL A H.Oxygen-limited fed-batch process:an alternative control forPichia pastorisrecombinant protein processes[J].Bioproc Biosyst Eng,2005,27(6):399-406.

[11]于景芝.酵母生產(chǎn)與應(yīng)用手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2005.

[12]STADLMAYR G,MECKLENBRAUKER A,ROTHMULLER M,et al. Identification and characterisation of novelPichia pastorispromoters for heterologous protein production[J].J Biotechnol,2010,150(10):519-529.

[13]宋留君，周長林，竇潔.甘油對畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)重組水蛭素II的影響[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2006，37（4）：371-374.

[14]HEYLAND J,FU J,BLANK L M,et al.Quantitative physiology of Pichia pastorisduring glucose-limited high-cell density fed-batch cultivation for recombinant protein production[J].Biotechnol Bioeng,2010, 107(2):357-368.

[15]閆亞軍，陳勁春.利用轉(zhuǎn)基因畢赤酵母高表達(dá)小分子藥用多肽的研究[J].北京化工大學(xué)學(xué)報，2002，29（4）：1-3.

Optimization of fermentation conditions for methanol protein production byPichia pastoris

GOU Wanxiao1,WEI Hongwei2,HU Yuansen2,WANG Le2*

(1.Coal Biochemical Technology Engineering Co.,Ltd.of Yima Coal Industry Group,Yima 472300,China; 2.College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

Pichia pastorisYM-SCP02 strain bred and domesticated in laboratory with high methanol protein yield was used for methanol protein production.The key factors of methanol protein fermentation were investigated and optimized,and the optimal fermentation conditions in the shake flask were determined as follows:inoculum 8%,segmented fermentation temperature 0-36 h,30℃and 36-64 h,28℃,initial pH 5.0,initial methanol addition 1.2%,liquid volume 50 ml/250 ml shake flask,and rotate speed 200 r/min.Under these conditions,the highest yield of methanol protein(cell dry weight)was 19.3 g/L.

methanol protein;Pichia pastoris;fermentation;technology conditions;optimization

TQ920.6

A

0254-5071（2014）07-0078-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.017

2014-05-08

河南工業(yè)大學(xué)博士科研基金項目（150493）

茍萬曉（1964-），男，工程師，本科，研究方向為生物化工。

*通訊作者：王樂（1984-），男，講師，博士，研究方向為發(fā)酵工程。