清胰湯對(duì)SAP合并感染患者單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)的影響

湯魯明 王林霞 孫來(lái)芳龔裕強(qiáng) 孔萬(wàn)權(quán) 王志翊

·臨床研究·

清胰湯對(duì)SAP合并感染患者單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)的影響

湯魯明 王林霞 孫來(lái)芳★龔裕強(qiáng) 孔萬(wàn)權(quán) 王志翊

目的探討清胰湯對(duì)重癥急性胰腺炎（SAP）并發(fā)感染患者單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)的影響。方法33例SAP合并感染患者隨機(jī)分成3組：SAP并發(fā)感染組（Ⅱ組）、GM-CSF治療組（Ⅲ組）、清胰湯治療組（Ⅳ組）；選取7例SAP未并發(fā)感染患者為對(duì)照組（Ⅰ組）；各組均予常規(guī)治療，Ⅲ、Ⅳ組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用GM-CSF或清胰湯治療，一周后檢測(cè)外周血WBC，血淀粉酶，ET，CRP，IL-6以及單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)率。結(jié)果Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組患者在各項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)均高于Ⅰ組，單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)水平低于Ⅰ組（P＜0.05）；而Ⅲ、Ⅳ組患者各項(xiàng)指標(biāo)較Ⅱ組明顯改善（P＜0.05）。結(jié)論SAP并發(fā)感染患者存在單核細(xì)胞免疫功能缺陷，而清胰湯治療能夠改善這種免疫功能障礙以及過(guò)度炎癥反應(yīng)。

清胰湯 重癥急性胰腺炎合并感染 單核細(xì)胞免疫功能 人類(lèi)白細(xì)胞抗原DR 炎癥反應(yīng)

過(guò)度炎癥反應(yīng)和免疫功能紊亂在重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）發(fā)病過(guò)程中序貫出現(xiàn)，是SAP患者合并嚴(yán)重感染導(dǎo)致病情惡化出現(xiàn)多器官功能不全（MODS）以及死亡的主要原因。外周血單核細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)最重要的一類(lèi)抗原呈遞細(xì)胞，而其細(xì)胞表面足夠的人類(lèi)白細(xì)胞抗原DR（HLA-DR）表達(dá)是維持其抗原呈遞功能的前提。近年來(lái)，中藥清胰湯已被廣泛應(yīng)用于急性胰腺炎的治療。本研究旨在通過(guò)觀察清胰湯治療SAP合并感染患者對(duì)外周血單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)水平和一些炎癥指標(biāo)的影響，從而闡明清胰湯治療急性胰腺炎可能的作用機(jī)制。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2007年5月至2009年7月本院收治40例SAP患者，其中男25例，女15例；年齡30～60歲，平均年齡（46±9）歲。APACHE II評(píng)分8～12分；均經(jīng)B超檢查，提示胰腺腫大而予以確診，部分病例經(jīng)CT檢查而確診，診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)胰腺病學(xué)組制訂的標(biāo)準(zhǔn)［1］。排除血液病、惡性腫瘤患者及孕婦。SAP并發(fā)感染是指在胰腺壞死基礎(chǔ)上由細(xì)菌、真菌等引起的全身或局部感染。臨床判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）腹膜刺激征范圍≥2個(gè)象限。（2）T≥38℃。（3）WBC≥20×109/L。（4）術(shù)中收集壞死組織細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性或細(xì)針穿刺抽吸物涂片找到細(xì)菌或細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性或腹水、血培養(yǎng)陽(yáng)性。可分為：全身感染：肺部感染、腹腔積液感染及敗血癥等。胰周膿腫：胰周積液伴胰周感染或抽取胰周積液細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性。真菌感染：體液涂片找到真菌菌絲或孢子。

1.2 分組及治療方法 將入選的病例分為未合并感染組和合并感染組，其中合并感染患者分成3組，各組分別為Ⅰ組：SAP組7例：患SAP但未并發(fā)感染者，即經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)治療后尚未發(fā)生感染者。Ⅱ組：SAP并發(fā)嚴(yán)重感染組11例。Ⅲ組：SAP并發(fā)感染后應(yīng)用GM-CSF治療組10例。Ⅳ組：SAP并發(fā)感染后應(yīng)用清胰湯治療組12例。另取正常健康者20例為正常組。所有患者均給予常規(guī)綜合治療，包括禁食、胃腸減壓、奧美拉唑、生長(zhǎng)抑素、抗生素、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)等［2］。各組患者在入選的年齡、性別、體重、病因等一般臨床資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。Ⅳ組患者經(jīng)胃管內(nèi)灌注清胰湯，閉管2h。方用清胰湯加減：大黃15g（后下），南柴胡10g，白芍10g，黃芩13g，胡黃連10g，木香10g，丹皮10g，元胡10g。水煎200ml，1劑/d，分2次胃管內(nèi)注入，連用6d。

1.3 觀察指標(biāo)及方法 （1）血樣的抽?。焊鹘M患者治療一周后留取外周血25ml，取其中10ml血按照常規(guī)方法檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC），血淀粉酶，內(nèi)毒素（ET），C反應(yīng)蛋白（CRP）；另取15ml稀釋后，加于淋巴細(xì)胞分離液的表面，2000 r/min離心20min，取中間層，收集外周血單個(gè)核細(xì)胞。（2）取血標(biāo)本：2ml注入無(wú)菌去熱源的試管內(nèi)，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清白介素-6（IL-6）的水平，具體步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。（3）應(yīng)用流式細(xì)胞儀：測(cè)定所有受試對(duì)象的外周血單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)率，取肝素抗凝血標(biāo)本1ml，參照試劑說(shuō)明書(shū)以PE標(biāo)記anti-HLA-DR/Per-CP-Cy5.5標(biāo)記anti-Monocyte雙色熒光抗體標(biāo)記后，流式細(xì)胞儀（FACscan）測(cè)定細(xì)胞的HLA-DR陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清學(xué)指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。

2.2 各組患者HLA-DR表達(dá)率的比較 Ⅰ組患者和Ⅱ組患者較正常組明顯降低，說(shuō)明在SAP患者以及SAP并發(fā)感染的患者體內(nèi)確實(shí)存在單核細(xì)胞無(wú)能狀態(tài)。Ⅲ組、Ⅳ組較Ⅱ組患者明顯升高（P＜0.05），且Ⅲ組比Ⅳ組升高更為明顯（P＜0.05），提示GM-CSF、清胰湯治療均能改善SAP并發(fā)感染患者體內(nèi)存在的單核細(xì)胞無(wú)能狀態(tài)。見(jiàn)表1。

表1 各組治療1周后血清學(xué)指標(biāo)比較（x±s）

3 討論

大量研究表明，重癥急性胰腺炎的初始階段主要是分泌大量炎性介質(zhì)為主要特征，隨著SAP的進(jìn)展，機(jī)體出現(xiàn)一個(gè)免疫抑制階段，使機(jī)體對(duì)病原體的易感性明顯減弱。而且，隨著危重病救治技術(shù)的提高，早期MODS的發(fā)病率和病死率已經(jīng)有所降低，但后期并發(fā)感染已成為死亡的重要原因。因此，如何增強(qiáng)患者免疫功能，減少并發(fā)感染機(jī)會(huì)成為提高SAP患者生存率新的治療切入點(diǎn)。單核細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，廣泛參與機(jī)體的免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)。HLA-DR是單核細(xì)胞表達(dá)的一種重要的MHC-Ⅱ類(lèi)抗原分子，其在向輔助性淋巴細(xì)胞遞呈抗原中發(fā)揮重要作用。而且，Lin［3］等發(fā)現(xiàn)當(dāng)單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)減少能夠?qū)е耇NF-α分泌減少和iNOS的表達(dá)減少，單核細(xì)胞的協(xié)同刺激能力減弱。因此，單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)水平是反映其免疫功能的一個(gè)重要指標(biāo)。據(jù)報(bào)道，SAP患者存在單核細(xì)胞無(wú)能狀態(tài)（anergy），主要表現(xiàn)為細(xì)胞表面HLA-DR分子表達(dá)降低和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）體外誘導(dǎo)SAP患者外周血單核細(xì)胞分泌TNF-α的能力下降。而且，粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和干擾素γ（IFN-γ）治療能夠明顯改善SAP患者單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)水平和分泌功能［4］。本研究同樣提示SAP患者存在單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)下降，而且，并發(fā)感染患者（Ⅱ組）比未感染患者（Ⅰ組）更為明顯，提示合并感染患者單核細(xì)胞免疫功能抑制更為嚴(yán)重。

清胰湯的配方主要成分為大黃和芒硝，配以柴胡、黃芩、枳實(shí)、白芍、厚樸和大香，其主要功效為清熱解毒、疏肝理氣、活血化瘀、通里攻下［5］，從而能保護(hù)胰腺細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放，保護(hù)腸黏膜，防止腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素的異位，以及調(diào)節(jié)Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性等［6］。目前我國(guó)對(duì)急性胰腺炎的非手術(shù)治療，倡導(dǎo)在西醫(yī)治療方法的基礎(chǔ)上予以清胰湯劑等復(fù)方湯劑作為中西醫(yī)結(jié)合治療重癥急性胰腺炎的規(guī)范化治療措施之一［7］。本研究結(jié)果顯示與陽(yáng)性對(duì)照組（GM-CSF治療組）相似，清胰湯治療組患者外周血單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)水平較Ⅱ組（SAP伴感染組）明顯提升，提示清胰湯治療能夠通過(guò)上調(diào)單核細(xì)胞表面HLA-DR表達(dá)水平從而增強(qiáng)其免疫功能。研究表明，清胰湯能通過(guò)保護(hù)腸黏膜屏障，減少細(xì)菌易位，降低血清中內(nèi)毒素水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放，防止過(guò)氧化損傷，糾正機(jī)體致炎和抗炎系統(tǒng)失衡等多方面機(jī)制，對(duì)機(jī)體起到全面防護(hù)作用。而攻下清熱活血藥物以及清胰湯方中大黃已被證實(shí)可以通過(guò)腸淋巴途徑明顯抑制TNF-α基因的表達(dá)，拮抗機(jī)體炎癥反應(yīng)，對(duì)IL-1β、IL-6、IL-18等細(xì)胞因子與內(nèi)毒素均有清除作用［8，9］。新近研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-10的大量分泌有助于SAP患者免疫功能紊亂發(fā)生［10］。因此，推測(cè)清胰湯可能通過(guò)抑制這些細(xì)胞因子的分泌而發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體單核細(xì)胞免疫功能的作用。

CRP是一種診斷早期炎性感染的敏感指標(biāo)，而IL-6是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞在外來(lái)刺激作用下產(chǎn)生的促炎因子。這種細(xì)胞因子的水平變化可反映體內(nèi)巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)［11］，它能協(xié)調(diào)IL-1促進(jìn)B細(xì)胞分化和抗體產(chǎn)生，誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)急性期蛋白的合成，是急性胰腺炎的致炎原因之一［12］。ET是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞趨化、移動(dòng)、釋放反應(yīng)的強(qiáng)力激活劑［13］，SAP時(shí)胰腺炎癥組織中已活化的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在受到內(nèi)毒素“攻擊”后，誘生促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等），造成SAP的“二次打擊”。因此，這些臨床常用的指標(biāo)能夠?qū)AP患者炎癥反應(yīng)程度作出準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。本研究在觀察清胰湯對(duì)單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)影響的同時(shí)，也評(píng)估了其對(duì)臨床常用炎癥指標(biāo)的作用。結(jié)果顯示應(yīng)用清胰湯治療可以降低患者CRP、WBC、ET和血淀粉酶水平，而且也下調(diào)重要促炎因子IL-6的表達(dá)，提示清胰湯增強(qiáng)SAP患者免疫功能的同時(shí)，能夠減輕SAP患者全身炎癥反應(yīng)，對(duì)于控制感染具有積極的治療意義。

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ObjectiveTo investigate the effect of Qingyi decoction on HLA-DR expression of the monocytes in the infectious patients with severe acute pancreatitis（SAP）.Method33 infectious patients with SAP were randomly divided into three groups：SAP complicated by infection group（Ⅱ），SAP complicated by infection treated by GM-CSF（Ⅲ），SAP complicated by infection treated by Qingyi decoction（Ⅳ）. Besides，7 SAP patients without infection were recruited to control group（Ⅰ）. All patients received routine comprehensive treatment after hospitalization，while group Ⅲ and group Ⅳ patients additionally received GM-CSF or Qingyi decoction as an adjutant therapy. All groups were treated for 7 days. The peripheral blood WBC，amylase，ET，IL-6，CRP were detected，and HLA-DR expression of monocytes were detected. Result The HLA-DR expression level of group Ⅱ，group Ⅲand group Ⅳ patients were lower than groupⅠ（P＜0.05），and the every serum index in them were higher than groupⅠ（P＜0.05）. Compared with the patients in group Ⅱ，the every serum index and the HLA-DR expression level of patients in groupⅢ and group Ⅳwere ameliorated（P＜0.05）.ConclusionMonocyte anergy is present in patients with severe acute pancreatitis，and SAP patients with infection are more severe. Furthermore，the treatment of Qingyi decoction can ameliorate monocytes-mediated immune function of SAP patients with infection and soften excessive inf ammatory response.

Qingyi decoction Severe acute pancreatitis with infection Monocytes-mediated immune function；human leukocyte antigen DR inf ammatory response

浙江省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目（2013RCA039）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急救中心

*通訊作者