鴨肝炎病毒的分離與鑒定

（青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266032）

鴨肝炎病毒的分離與鑒定

徐保娟，郭偉偉，宮 曉，李陸梅，宋新宇，范根成

（青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266032）

1999-2008年從山東、河南、浙江、江蘇、廣西、山西、江西、廣東、福建和遼寧等地有典型鴨病毒性肝炎癥狀的病死雛鴨中共分離得到22株病毒。用鴨肝炎病毒（DHV）Ⅰ型（DHV-1）抗血清和新型DHV （NDHV）抗血清對分離的22株病毒進行血清中和試驗；對22株病毒的抗原相關(guān)VP1基因進行RT-PCR擴增和測序，然后對VP1基因的核苷酸與推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析。結(jié)果表明，目前我國存在DHV-1和N-DHV兩種血清型。其中分離到的12株為DHV-1，10株為N-DHV。依據(jù)VP1基因序列同源性進行的血清型分型結(jié)果與根據(jù)抗原性鑒定進行的血清型分型結(jié)果一致。12株DHV-1的氨基酸序列同源性為95%左右，10株N-DHV的氨基酸同源性為98%左右；DHV-1分離株與N-DHV分離株間氨基酸同源性為72%～77%。同血清型病毒株間的VP1基因變異很小，表明DHV的抗原性穩(wěn)定。

鴨肝炎病毒；VP1基因；序列分析；血清型；分離；鑒定

鴨病毒性肝炎（duck viral hepatitis，DVH）是由鴨肝炎病毒（duck hepatitis virus，DHV）引起雛鴨的一種以肝臟為主要病理變化的急性、高度致死性、接觸性傳染病。臨床表現(xiàn)痙攣、抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀，以肝腫脹和出血為特征性病變。1～3周齡的雛鴨易感，發(fā)病嚴重，傳播迅速，雛鴨通常出現(xiàn)癥狀后的1小時內(nèi)死亡，10日齡雛鴨感染后死亡率高達90%～95%。1949年，美國Levine首先分離到鴨肝炎病毒，并命名為I型鴨病毒性肝炎病毒[1]。蘇敬良等在北京和廣西等地從3-13日齡疑似鴨肝炎的北京鴨和櫻桃谷鴨體內(nèi)分離到兩株與I型和Ⅲ型鴨病毒性肝炎病毒無血清學(xué)交叉免疫反應(yīng)的鴨肝炎病毒，認為出現(xiàn)了新的血清型，并將其命名為新型鴨肝炎病毒[2，3]。

自2006年以來，范書才、蘇敬良、Kim MC和Tseng等分別對各地區(qū)的DHV-1和N-DHV進行血清學(xué)與分子生物學(xué)系統(tǒng)鑒定，證實了N-DHV的存在[4-6]。有研究報道，DHV中的結(jié)構(gòu)蛋白VP1包含病毒的中和表位和主要抗原位點，是最易發(fā)生變異的區(qū)域，并與病毒的抗原性密切相關(guān)。Oberste等通過對VP1基因部分序列的同源性分析比較，建立了一種血清型分型標準：核苷酸序列同源性≥75%、推導(dǎo)的氨基酸序列同源性≥88%的毒株可判定為同一血清型[7]。

為了解我國鴨病毒性肝炎的流行情況，本研究對保存的1999—2008年從山東、河南、浙江、江蘇、廣西、山西、江西、廣東、福建和遼寧等地有典型鴨病毒性肝炎癥狀的病死雛鴨中分離得到的22株病毒，并對分離株進行血清型鑒定和易感鴨回歸試驗，對抗原相關(guān)的VP1基因進行擴增，參考GenBank登錄的毒株序列，進行VP1基因同源性及氨基酸序列突變差異分析，結(jié)果表明分離毒均為鴨肝炎病毒?，F(xiàn)將分離鑒定情況報告如下。

1 材料和方法

1.1 陽性血清

Ⅰ型和新型鴨肝炎病毒陽性血清均由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供，中和效價均為1∶1097。

1.2 鴨胚

12～13日齡麻鴨胚來源于無鴨肝炎病史、DHV抗體陰性的健康種鴨群，鴨胚液無菌檢驗、支原體檢驗和血凝性病毒檢驗均為陰性。

1.3 易感鴨

非免疫種鴨蛋購于北京興平旺畜禽養(yǎng)殖專業(yè)合作社，種蛋購回后由青島易邦生物工程有限公司實驗動物室按SPF雞要求孵化，負壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。

1.4 SPF雞

北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.5 病料及病料處理

1.5.1 病料。由青島易邦生物工程有限公司于1999—2008年從山東、河南、浙江、江蘇、廣西、山西、江西、廣東、福建和遼寧等地有典型鴨病毒性肝炎癥狀的病死雛鴨中采集，均為病死雛鴨肝臟，共35份。

1.5.2 病料處理。將無菌采集死亡雛鴨肝臟，剪碎后按照組織重量1∶4加入滅菌生理鹽水，高速勻漿制成肝組織乳劑，60目銅網(wǎng)過濾；收集濾液，加入氯仿（終濃度為5%），振蕩15min后，4℃，2000r/min離心20min，收集上清液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后作為接種用樣品。

1.6 病毒分離

用含200U/ml雙抗的生理鹽水將上述樣品做100倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種12-13日齡的易感鴨胚10枚，每胚0.2ml，置36～37℃繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察7日，記錄死胚情況。收集48-168小時死亡鴨胚的胚體，經(jīng)無菌檢驗合格后，作為鴨胚毒，--70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 病毒含量測定

將分離毒用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75個稀釋度，分別尿囊腔接種12～13日齡易感鴨胚各5枚，每胚0.2ml。同時設(shè)接種生理鹽水對照5枚，每胚0.2ml。置36～37℃繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察7日。以鴨胚死亡并出現(xiàn)尿囊膜水腫增厚，頭、頸、背部等全身出血性病變判為感染，計算ELD50。

1.8 血清中和試驗

用Ⅰ型或新型陽性血清分別與分離毒進行血清中和試驗。取適當(dāng)血清與含200ELD50/0.2 ml的病毒液等量混合，37℃作用1小時。同時，將病毒（含100 ELD50/0.2ml）和生理鹽水分別設(shè)為對照組。將各中和組、對照組經(jīng)尿囊腔接種10枚易感鴨胚，0.2ml/胚，置36～37℃繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察7日，每天記錄各組死胚數(shù)（24小時內(nèi)死亡胚棄之不計）。以病毒對照組鴨胚至少死亡8枚，生理鹽水對照組全部健活為試驗成立。中和組胚死亡判為感染，健活判為保護。

1.9 易感雛鴨回歸試驗

將分離毒用生理鹽水作10倍稀釋，分別肌肉注射接種3日齡易感雛鴨（來源種鴨群的Ⅰ型和新型鴨肝炎病毒中和抗體均＜1∶4）各10只，每只0.5ml，同時設(shè)生理鹽水接種對照組，各組保溫隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察10日。

1.10 主要試劑

RNA提取試劑盒購自天澤公司；反轉(zhuǎn)錄酶及反轉(zhuǎn)錄試劑均購自Takara公司；2000bp marker購自TaKaRa公司。

1.11 引物設(shè)計與合成

參考DRL-62株（DQ219396）與韓國N-DHV AP-04114株（DQ812093）基因組全序列，選擇VP1基因保守區(qū)域，使用gene runner軟件設(shè)計2對特異性引物，由上海生物工程有限公司合成。

DHV-1：

上游：GGTGATTCCAACCAGTTGGG

下游：TTCAATTTCCAGATTGAGTTCAAA

N-DHV：

上游：CAGATGGCCGCCAATGATCA

下游：GTCTCTGACATTTCGAAATTGG

1.12 RNA提取

按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。

1.13 RT-PCR擴增DHV-1、N-DHV VP1 PCR反應(yīng)條件

94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s、54℃退火30s、72℃延伸60s，35個循環(huán) ；72℃延伸10min ；4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物由上海生物工程有限公司測序。

1.14 序列分析

應(yīng)用DNAMan和MEGA4.0軟件將獲得的測序結(jié)果進行分析，將序列與GenBank中登錄的DHV參考病毒株VP1基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列進行序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。所用病毒株及GenBank登錄號為：SG（FJ971623）、AP-03337（DQ256132）、AP-04009（DQ256133）、AP-04203（DQ256134）、AP-04114（DQ812093）、DRL-62（DQ219396）、F（EU264072） 和GZ（EU888310）。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離結(jié)果

35份病料中有10份病料接種后24小時內(nèi)鴨胚全部死亡，細菌檢驗為陽性；3份病料接種后168小時內(nèi)鴨胚均無死亡；22份病料接種后96小時內(nèi)鴨胚死亡6枚以上，死亡鴨胚胚體水腫、出血，肝出血或有白色壞死點。結(jié)果表明共從35份病料中共分離到22株病毒，暫分別命名為SD01、SD02、SD03、SD05、HN1、HN2、GX1、LN6、LN7、SX8、ZJ1、ZJ4、ZJ5、JS1、JS2、JS3、JS5、FJ1、FJ2、FJ3、GD1、JX2。

2.2 病毒含量測定結(jié)果（詳見表1）

2.3 病毒株血清型鑒定結(jié)果

用Ⅰ型標準陽性血清和新型陽性血清，分別與各分離毒株進行鴨胚中和試驗。結(jié)果表明，JX2、SD03、ZJ1、ZJ5、JS1、JS3、JS5、FJ1、GX1、LN6、LN7和SX8株病毒僅能夠被Ⅰ型鴨肝炎病毒陽性血清所中和，屬于Ⅰ型鴨肝炎病毒；而SD01、SD02、SD05、FJ2 、FJ3、ZJ4、JS2、HN1、HN2和GD1株病毒僅能夠被新型鴨肝炎病毒陽性血清所中和，屬于新型鴨肝炎病毒。

2.4 易感雛鴨回歸試驗結(jié)果

易感雛鴨接種后均發(fā)病，死亡均在6只以上，雛鴨發(fā)病后的臨床癥狀與臨床病例基本一致，具有典型的鴨病毒性肝炎癥狀。發(fā)病和死亡情況詳見表2。

表1分離毒病毒含量檢測結(jié)果（ELD50/0.2ml）

表2分離毒易感雛鴨回歸試驗結(jié)果

圖1A DHV-1引物擴增條帶

圖1B N-DHV引物擴增條帶

2.5 RT- PCR檢測結(jié)果

采用DHV-1標準毒株VP1基因的引物進行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，JX2、SD03、ZJ1、 ZJ5、JS1、JS3、JS5、FJ1、GX1、LN6、LN7和SX8株均擴增出大小約710 bp的目的條帶（圖1A）；采用韓國N-DHV株VP1基因的引物進行RT-PCR擴增，結(jié)果顯示，SD01、SD02、SD05、FJ2 、FJ3、ZJ4、JS2、HN1、HN2和GD1株病毒均擴增出大小約760bp的目的條帶（圖1B）。

2.6 VP1基因同源性分析

利用DNAMan軟件對擴增的22株病毒的VP1基因進行序列分析，比較不同血清型毒株VP1基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性和差異。結(jié)果顯示，JX2、SD03、ZJ1、ZJ5、JS1、JS3、JS5、FJ1、GX1、LN6、LN7和SX8株與標準毒株DRL-62 株的核苷酸序列同源性在91.7%～95.5%之間，氨基酸序列同源性在90.6%～94.9%之間；與其他N-DHV毒株的核苷酸序列同源性為70%左右，氨基酸序列同源性小于75%。SD01、SD02、SD05、FJ2 、FJ3、ZJ4、JS2、HN1、HN2和GD1株與DRL-62株的核苷酸序列同源性在69.1%～71.7%之間，氨基酸序列同源性在68.4%～70.3%之間；與新型DHV的SD01毒株核苷酸序列同源性在92.5%～99.0%之間，氨基酸序列同源性在91.2%～98.3%之間，10株病毒間的核苷酸序列同源性在96.5%～99.0%之間，氨基酸序列同源性在96.2%～99.2%之間。

2.7 依據(jù)VP1基因同源性的血清型分型

參照同屬于微RNA病毒的人腸病毒（Human Enteroviruses）血清型分型標準，即VP1基因的核苷酸序列同源性≥75%、推導(dǎo)的氨基酸序列同源性≥88%的毒株可判定為同一血清型。根據(jù)各毒株VP1基因核苷酸及氨基酸序列同源性分析的結(jié)果，可判定，JX2、SD03、ZJ1、ZJ5、JS1、JS3、JS5、FJ1、GX1、LN6、LN7和SX8株與DRL-62株屬于同一血清型（核苷酸序列同源性＞95%，推導(dǎo)氨基酸序列同源性＞93%）；SD01、SD02、SD05、FJ2 、FJ3、ZJ4、JS2、HN1、HN2和GD1株與DRL-62株屬于不同的血清型（ 核苷酸序列同源性＜69%，推導(dǎo)氨基酸序列同源性＜78%）；與韓國N-DHV株屬于同一血清型（核苷酸序列同源性＞92%，推導(dǎo)氨基酸序列同源性＞91%）。

2.8 遺傳進化分析

采用MEGA4.0軟件對DHV各毒株VP1氨基酸序列進行比對，繪制遺傳進化樹。結(jié)果表明JX2、SD03、ZJ1、ZJ5、JS1、JS3、JS5、FJ1、GX1、LN6、LN7和SX8株與DRL-62株屬同一基因型，而與SD01處于不同分支；SD02、SD05、FJ2、FJ3、ZJ4、JS2、HN1、HN2和GD1與SD01株屬同一基因型，而與DHV-1（DRL-62株）處于不同分支。

3 討論

本研究從不同地區(qū)采集的35份病料中分離到了22株病毒，經(jīng)血清學(xué)鑒定均為鴨肝炎病毒，但其中12株為Ⅰ型鴨肝炎病毒，10株為新型鴨肝炎病毒；22株分離毒接種易感雛鴨后均出現(xiàn)典型的鴨病毒性肝炎癥狀。依據(jù)VP1基因劃分血清型標準，對以上DHV各分離株血清型進行判定，結(jié)果表明，JX2、SD03、ZJ1、ZJ5、JS1、JS3、JS5、FJ1、GX1、LN6、LN7和SX8株屬Ⅰ型鴨肝炎病毒；SD01、SD02、SD05、FJ2 、FJ3、ZJ4、JS2、HN1、HN2和GD1株屬于新型鴨肝炎病毒；依據(jù)VP1基因序列同源性進行的血清型分型結(jié)果與依據(jù)抗原性鑒定進行的血清型分型結(jié)果完全一致。

分析、遺傳進化樹與血清型判定各項結(jié)果均表明：JX2、SD03、ZJ1、ZJ5、JS1、JS3、JS5、FJ1、GX1、LN6、LN7和SX8株與DRL-62株處于同一進化分支，親緣關(guān)系密切。SD02、SD05、FJ2 、FJ3、ZJ4、JS2、HN1、HN2和GD1株與SD01株共同組成一個遺傳關(guān)系群。對22株DHV VP1氨基酸突變差異分析表明，變異可能與毒株的生物學(xué)特性、采樣時間、地點有一定的關(guān)系。血清型鑒定與抗原相關(guān)VP1基因序列分析結(jié)果表明，我國目前存在DHV-1和N-DHV兩種DHV同時流行。依據(jù)VP1 氨基酸序列構(gòu)建的遺傳進化樹顯示：12株DHV-1與DRL-62株處于同一進化分支；10株N-DHV與韓國N-DHV AP-04114毒株處于同一進化分支，同進化支毒株間遺傳關(guān)系密切。國內(nèi)DHV-1和N-DHV各分離毒株間基因差異較小，抗原性穩(wěn)定，未產(chǎn)生亞型變異。本研究為雛鴨病毒性肝炎的診斷和防治提供重要依據(jù)。

[1] Levine p p，F(xiàn)abricant J.A hitherto-undescribed virus disease of ducks in North America[J].Cornell Vet，1950，40：71-86.

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Isolation and Identifcation of Duck Hepatitis Virus

Xu Baojuan，Guo Weiwei，Gong Xiao，Li Lumei，Song Xinyu，F(xiàn)an Gencheng

（Qingdao Yebio Bio-engineering Co Ltd，Qingdao，Shandong 266032）

22 strains of duck hepatitis virus （DHV） were isolated from sick or died ducks with typical symptoms of duck hepatitis in Shandong，Henan，Zhejiang，Jiangsu，Guangxi，Shanxi，Jiangxi，Guangdong，F(xiàn)ujian and Liaoning Provinces from 1999 to 2008. Serum neutralization test were conducted using duck hepatitis virus I type （DHV-1）antiserum and the new DHV （N-DHV） antiserum with these 22 strains. The VP1 genes of the isolated strains were amplifed using RT-PCR and then sequenced. Amino acid sequences of VP1 were then deduced and analyzed. The results showed that there were two serotypes of DHV in China. Among the 22 strains，12 strains were in DHV-1 and 10 strainsin N-DHV. The serotyping result based on the homology of VP1 gene sequences was identical to the result based on the antigenicity serotyping. Amino acid sequence homology was 95% within 12 DHV-1 strains and 98% within 10 N-DHV strains respectively. The amino acid homology of VP1 gene was 72～77% between DHV-1 and N-DHV strains. The less variation of VP1 gene in the same serotype strains suggested that the antigenicity of DHV was stable.

duck hepatitis virus；VP1 gene；sequence analysis；serotype；isolation；identifcation

S852.65

：A

：1005-944X（2014）09-0064-05