廣西羅非魚和卵形鯧鲹海豚鏈球菌的生化特性及基因多態(tài)性分析

黃婷，李莉萍，王瑞，梁萬文，羅洪林，陳福艷，張彬，楊傳萍，羅永巨，陳明，甘西

(1.廣西水產(chǎn)科學研究院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西 南寧530021;2.安徽省當涂縣水產(chǎn)局，安徽 當涂243100)

研究海豚鏈球菌的血清型有助于有針對性地制定海豚鏈球菌病的防控措施。海豚鏈球菌不能采用傳統(tǒng)的Lancefield 鏈球菌血清型分型方法對其進行血清型鑒定［1］，因此，至今尚未建立其血清型鑒定系統(tǒng)。以色列、美國、日本和中國分別采用血清凝集試驗和/或RAPD 方法，研究報道了各地海豚鏈球菌流行菌株所具有的不同血清型［2-5］，然而，因無標準血清，加之所采用的分型方法不同，對目前海豚鏈球菌究竟有幾種血清型尚不清楚。隨機擴增多態(tài)性DNA 標記(RAPD)技術因其具有快速可靠、靈敏度高、檢測容易、樣品用量少等優(yōu)點，近年來被廣泛應用于細菌、真菌、支原體等微生物的血清型分型研究中。Bachrach等［2］采用RAPD 技術證實，不同血清型(Ⅰ和Ⅱ型)的海豚鏈球菌具有兩種不同的RAPD 帶型(基因多態(tài)性)。

目前國內關于海豚鏈球菌血清型的研究僅見兩例報道。周素明［5］采用微量凝集方法，以國外標準株為對照，對廣東省所分離的26 株海豚鏈球菌及浙江省所分離的1 株分離菌株進行了血清型鑒定，結果表明，海豚鏈球菌分為2種血清型;程爽［6］采用RAPD 技術對山東省分離到的1 株海豚鏈球菌SF1 進行基因多態(tài)性分析，確認其與血清型Ⅰ型海豚鏈球菌的基因多態(tài)性一致。國內對海豚鏈球菌血清型的研究局限于廣東省、山東省和浙江省的臨床菌株，尚未對其他地區(qū)海豚鏈球菌臨床菌株的血清型進行深入研究。本研究中，采用RAPD 技術對2006—2011年從廣西分離到的22 株海豚鏈球菌進行基因多態(tài)性分析，以期闡明廣西海豚鏈球菌的基因多態(tài)性特征，為針對性地篩選中國羅非魚海豚鏈球菌病疫苗候選菌株及疫苗研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

細菌基因組DNA 提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，細菌API 20 生化鑒定試劑條購自法國梅里埃試劑有限公司，Taq DNA 聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司，PCR所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

本試驗中所用菌株均為廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室2006—2011年從廣西養(yǎng)殖的羅非魚Oreochromis Niloticus和卵形鯧鲹Trachinotus ovatus 中分離的海豚鏈球菌流行菌株，各菌株詳細信息如表1所示。

表1 試驗菌株信息Tab.1 Information on the experimental bacterial strains

1.2 方法

1.2.1 二重PCR 鑒定 將細菌置于含TSB 液體的培養(yǎng)基中，28 ℃下振蕩培養(yǎng)24 ～48 h 后，按細菌DNA 抽提試劑盒說明書操作，抽提23 株細菌的基因組DNA，分裝后于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。二重PCR 擴增參照黎炯等［7］的方法進行，無乳鏈球菌引物為

P-F:5' AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT 3'，

P-R:5' CAGTAATCAAGCCCAGCAA 3'。

海豚鏈球菌引物為

P-F:5' CTAGAGTACACATGTACTTAAG 3'，

P-R:5' GGATTTTCCACTCCCATTAC 3'。

無乳鏈球菌特異性擴增片段大小為474 bp，海豚鏈球菌特異性擴增片段大小為296 bp。

1.2.2 海豚鏈球菌的生化鑒定 生化鑒定步驟參照API STREP 20 試劑條使用說明書進行。

1.2.3 隨機擴增多態(tài)性DNA 標記(RAPD)分析

以23 株細菌的基因組DNA 為模板，以5' GATCAAGTCC 3'［2］為引物，進行RAPD PCR。PCR 體系(共50 μL):10 ×Buffer(Mg2+)5.0 μL，dNTP 4.0 μL，引物1.0 μL，DNA 模板0.5 μL，Takara Ex Taq(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 39.0 μL。PCR儀器為德國Biometra 公司的T GraDient。PCR 反應程序:95 ℃下預變性5 min;95 ℃下變性30 s，38℃下退火1 min，72 ℃下延伸1 min，共進行30 個循環(huán);最后在72 ℃下再延伸10 min。用15 g/L 瓊脂糖凝膠進行電泳，用GoldView Ⅰ型核酸染色劑進行染色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結果

2.1 二重PCR 擴增

23 株海豚鏈球菌二重PCR 檢測結果見圖1。陽性對照出現(xiàn)2 條特異性條帶，23 株海豚鏈球菌均在預期296 bp 處出現(xiàn)了目的條帶。

圖1 23 株菌株的二重PCR 擴增圖Fig.1 Duplex PCR analysis of the 23 bacterial strains

2.2 生化鑒定分型

23 株細菌的生理生化試驗詳細結果見表2。由表2可知，GX003、GX005、GX023和GX025 的精氨酸水解(ADH)呈陰性反應，其余均為陽性。

表2 23 株試驗菌株的生化反應結果Tab.2 Biochemical characterization of the 23 bacterial strains

2.3 隨機擴增多態(tài)性DNA 標記

隨機擴增多態(tài)性DNA 標記結果見圖2。1 號菌株為海豚鏈球菌標準菌株ATCC 29178，其在750 bp 處出現(xiàn)了特異性條帶。本實驗室分離到的另外22 株菌株也均在750 bp 處出現(xiàn)了特異性條帶，且均出現(xiàn)3 條明顯的條帶。推測本實驗室分離保存的23 株菌與海豚鏈球菌標準菌株ATCC 29178 屬于同一個血清型，均為血清型Ⅰ型海豚鏈球菌。

圖2 RAPD 分析菌株電泳圖Fig.2 RAPD analysis of the 23 bacterial strains

3 討論

近年來，中國羅非魚養(yǎng)殖深受鏈球菌病的危害，嚴重影響了羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。2009年前還可用抗生素控制病情，而近幾年抗生素的效果越來越不明顯。防治該病的有效途徑是使用疫苗，但相關文獻報道疫苗在使用時免疫效果差異較大，曾經(jīng)免疫效果很好的疫苗，后來卻失去免疫保護作用［2，8］。筆者在幾年的生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，有些養(yǎng)殖場使用疫苗后幾乎不發(fā)病，而有些則是推遲發(fā)病，推測這可能與各時期、各區(qū)域病原血清型差異有關。Bachrach等［2］對海豚鏈球菌血清型與基因多態(tài)性進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)以色列1997—2000年分離到的海豚鏈球菌較之前分離菌株具有不同的基因多態(tài)性，并且2種基因多態(tài)性對應2種血清型，即基因多態(tài)性中出現(xiàn)750 bp 條帶的菌株對應血清型Ⅰ型海豚鏈球菌，未出現(xiàn)750 bp 條帶的菌株對應血清型Ⅱ型海豚鏈球菌。國內對海豚鏈球菌的研究起步較晚，柴家前等［9］最早(2002年)報道了中國羅非魚海豚鏈球菌病;周素明［5］于2010年首次報道了廣東省分離的海豚鏈球菌有2種不同的血清型，研究發(fā)現(xiàn)，標準菌株ATCC29178、浙江分離株SO-2、淡水菌株(廣東)與海水菌株(廣東)屬于同一類的血清型;本研究結果表明:廣西地區(qū)從2006—2011年，海豚鏈球菌的基因多態(tài)性未發(fā)生變化，標準菌株ATCC 29178、淡水菌株(廣西)與海水菌株(廣西)的基因多態(tài)性相同，根據(jù)Bachrach等［2］的研究結果，可推測廣西所分離的菌株均為血清型Ⅰ型海豚鏈球菌;程爽［6］也研究發(fā)現(xiàn)，海水菌株SF1 屬于血清型Ⅰ型海豚鏈球菌。國內外的研究結果表明，海豚鏈球菌目前至少存在2種不同血清型，這些結果為今后疫苗的研發(fā)及疫苗在國內的應用提供了理論依據(jù)。

Barnes等［3］研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸水解酶為陽性的海豚鏈球菌，其RAPD 分型能擴增出750 bp 的特異條帶;而精氨酸水解酶為陰性的海豚鏈球菌，其RAPD 分型則在750 bp 無特異性條帶。本試驗研究結果與Barnes等［3］的研究結果不同，RAPD 反應在750 bp 處均出現(xiàn)了特異性條帶，但是GX003、GX005、GX023和GX025 的精氨酸水解酶呈陰性反應。本試驗結果與周素明［5］的研究結果也存在差異，周素明所分離的2 個血清類群的所有菌株的精氨酸水解酶反應均呈陽性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，可能歸因于生理生化鑒定結果的不準確性或試驗人員個體主觀判斷誤差;也可能是筆者收集的菌株不夠多，具體原因有待進一步研究。

［1］Pier Q B，Madin S H.Streptococcus iniae，a beta-hemolytic Streptococcus isolated from an Amazon freshwater dolphin，Inia geoffrensis［J］.Int J Syst Bacterio，1976，26:545 -553.

［2］Bachrach G，Zlotkin A，Hurvitz A，et al.Recovery of Streptococcus iniae from diseased fish previously vaccinated with a Streptococcus vaccine［J］.Appl Environ Microbiol，2001，67:3756 -3758.

［3］Barnes A C，Young E M，Home M，et al.Streptococcus iniae:serological differences，presence of capsule and resistance to immune serum killing［J］.Dis Aquat Organ，2003，53(3):241 -247.

［4］Kinya K，Masakazu N，Tatsuo K，et al.Serological characterization of Streptococcus iniae strains isolated from cultured fish in Japan［J］.Fish Patho，2006，41:57 -66.

［5］周素明.魚類海豚鏈球菌流行病學及診斷技術的研究［D］.廣州:中山大學，2010.

［6］程爽.一株海豚鏈球菌的分離鑒定及其亞單位疫苗研究［D］.青島:中國科學院研究生院(海洋研究所)，2010.

［7］黎炯，葉星，盧邁新，等.雙重PCR 快速鑒別無乳鏈球菌和海豚鏈球菌［J］.湖南農業(yè)大學學報:自然科學版，2010，36(4):449 -452.

［8］Eldar A，Horovitcz A，Bercovier H.Development and efficacy of a vaccine against Streptococcus iniae infection in farmed rainbow trout［J］.Vet Immunol Immunopathol，1997，56(1/2):175 -183.

［9］柴家前，丁巧玲，王振龍，等.羅非魚鏈球菌的分離鑒定［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2002，24(1):l8 -20.