貴州白香豬白細(xì)胞介素4全基因的克隆與序列分析

梁海英，曾智勇，王偉丞，湯德元，劉 釗

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

白細(xì)胞介素4(Interleukin-4，IL-4) 主要由活化的T細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)T，B淋巴細(xì)胞的分化、活化，促進(jìn)Th2細(xì)胞為特征的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[1]。有關(guān)IL-4研究較多，用于抗腫瘤、抗感染、抗炎癥和作為新型的免疫增強(qiáng)劑，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[2-3]。自1982年由Howard等人首次發(fā)現(xiàn)IL-4以來(lái)，許多物種，如人、豬、牛、羊等的IL-4 cDNA相繼被克隆成功，并對(duì)其分子結(jié)構(gòu)和體內(nèi)外生物學(xué)活性進(jìn)行了研究[4-5]。

貴州白香豬是貴州省地方特色小型豬種，原產(chǎn)于貴州劍河縣，具有體型小，基因純合，肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)[6-7]。發(fā)展貴州白香豬的飼養(yǎng)可有效地推動(dòng)貴州地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)有關(guān)貴州白香豬的IL-4基因及其免疫學(xué)特性的研究報(bào)道，本試驗(yàn)擴(kuò)增并克隆其IL-4基因cDNA，旨在為深入了解IL-4在該類(lèi)小型豬種免疫系統(tǒng)及免疫應(yīng)答中的作用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為研制新型高效分子佐劑創(chuàng)造條件，對(duì)發(fā)展貴州白香豬特色養(yǎng)殖業(yè)具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 供試動(dòng)物、質(zhì)粒及菌株

貴州白香豬，購(gòu)自貴州大學(xué)香豬種豬場(chǎng)；pMD18-T Simple Vector購(gòu)自大連寶生物公司；大腸桿菌感受態(tài)Top10菌株由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 主要試劑

人淋巴細(xì)胞分離液為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院產(chǎn)品；胎牛血清、改良型RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；ConA購(gòu)自Sigma公司；Trizol試劑購(gòu)自invitrogen公 司；PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2一步RT-PCR試劑盒、BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、分子量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000購(gòu)自大連寶生物 公 司；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit(50)膠回收試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品；普通質(zhì)粒小提試劑盒為T(mén)IANGEN公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank中豬白介素4基因序列（登錄號(hào)為NM _214123），應(yīng)用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)如下克隆引物：

IL-4-S：5-CGGGATCCTTCAT GGGTCTCACCTC-3；

IL-4-As：5-CGGAATTCTCAG CTTCAACACTTTGA -3。

為了便于克隆，分別在其兩端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)（劃線部分）預(yù)期擴(kuò)增大小為427 bp。引物由大連寶生物公司合成。

1.4 豬淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

無(wú)菌采取健康貴州白香豬前腔靜脈血20 mL，用3.8%檸檬酸鈉抗凝；加入等量的D-Hank，s液稀釋混勻；取稀釋的外周血緩慢加入等量的淋巴細(xì)胞分離液上；室溫2 000r/min離心20 min；小心吸取霧狀層，加入D-Hank，s液洗滌，室溫2 000 r/min離心10 min洗滌3次，棄上清；沉淀細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（含青、鏈霉素各100 μg/mL）懸??；加入刀豆蛋白ConA 至終濃度為10 μg/mL誘導(dǎo)刺激，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。

1.5 淋巴細(xì)胞總RNA的提取

收集誘導(dǎo)48 h的淋巴細(xì)胞于15 mL離心管中，室溫2 000 r/min離心10 min，棄上清；向沉淀中加入1 mL Trizol，渦旋振蕩器劇烈振蕩以裂解細(xì)胞，將裂解液轉(zhuǎn)入一新的Ep管中，室溫放置5 min；加入氯仿200 μL，用力振蕩15 s，室溫靜置3 min，4 ℃12 000 r/min離心15 min；小心吸取上層水相，加入500 μL異丙醇，充分混勻后于-20 ℃靜置20 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇渦旋混勻洗滌沉淀，4 ℃12 000 r/min離心10 min；棄上清，沉淀于室溫自然干燥，加入20 μL DEPC處理水溶解RNA，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 IL-4基因RT-PCR擴(kuò)增

圖1 IL-4基因的RT-PCR鑒定結(jié)果

圖2 質(zhì)粒pMD18-IL-4質(zhì)粒的PCR和雙酶切鑒定結(jié)果

參照一步RT-PCR試劑盒說(shuō)明，RT-PCR反 應(yīng) 體 系：2×1 Step Buffer 25 μL, 總 RNA 5 μL, PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL, 上下游引物各2.5 μL，RNase Free H2O 0.5 μL。 按以下條件進(jìn)行反應(yīng)：50 ℃ 40 min；94 ℃5 min ；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35cycle；72 ℃ 10 min。

圖3 pIL-4基因推導(dǎo)的氨基酸序列的一致性分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 IL-4基因的克隆與鑒定

將經(jīng)回收純化的RT-PCR產(chǎn)物與pMD18-T Simple載體按常規(guī)方法進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Top10。挑取白色菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，小劑量試劑盒提取質(zhì)粒DNA，將經(jīng)PCR及酶切鑒定的克隆質(zhì)粒送至大連寶生物公司測(cè)序，并命名為pMD18-IL-4。

1.8 序列分析

應(yīng) 用DNAStar 7.0和MEGA5.0生物學(xué)軟件對(duì)貴州白香豬IL-4基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，并與目前Genebank中已發(fā)表的其他IL-4基因序列進(jìn)行同源性分析并繪制IL-4基因遺傳進(jìn)化樹(shù)。豬源參考序 列 ：AF493991(Chenghua pig，China)，HQ236500（Guangxi Bama pig, China），L12991（Sus scrofa），N M 2 1 4 1 2 3(L a r g e W h i t e)，X68330(Large white，England)。不同物種IL-4的參考序列：AF239917（Dog，狗），AM937235(Homo sapiens，智人)，M13982（Human，人），JQ432546（Horse，馬），M25892(Mus musculus，鼠 )，M77120(Bovine，牛 )，NM_001009313(Ovis aries ，綿羊)，U39634(Catus，貓)，XM_005024359(Anas platyrhynchos，鴨 )。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

圖4 豬源IL-4基因推導(dǎo)的氨基酸序列的遺傳進(jìn)化樹(shù) 圖5 不同種屬動(dòng)物IL-4基因推導(dǎo)的氨基酸序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)

以總RNA為模板，擴(kuò)增出一條與預(yù)期片段大小427 bp相符的特異性條帶（圖1）。

2.2 重組克隆質(zhì)粒的鑒定

將純化的IL-4基因RT-PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，提取質(zhì)粒，PCR及酶切鑒定結(jié)果均可見(jiàn)目的條帶，表明已成功構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD18-IL-4（圖 2）

2.3 重組質(zhì)粒pMD18-IL-4的測(cè)序結(jié)果

挑取已鑒定的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，送大連寶生物公司測(cè)序，結(jié)果表明IL-4基因已成功克隆至 pMD18-T Simple載體，其ORF長(zhǎng)為402 bp，編碼133個(gè)氨基酸，該序列已收錄入GenBank，登錄號(hào)為JF906512。通過(guò)信號(hào)肽序列的Signal4.0在線分析結(jié)果表明，貴州白香豬IL-4 ORF編碼的氨基酸序列中前24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，成熟肽由后面109個(gè)氨基酸構(gòu)成。N-糖基化位點(diǎn)的NetNGlyc1.0在線分析表明，該推導(dǎo)氨基酸序列有3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別位于第62～64位、96～98位和102～104位氨基酸處。

2.4 IL-4基因的氨基酸一致性分析

貴州白香豬IL-4基因序列與Genbank中其他IL-4基因氨基酸一致性分析結(jié)果（圖3）表明：貴州白香 豬 與 AF493991（99.4%），L12991（98.1%）氨基酸一致性相對(duì)較低外，與其他豬源IL-4基因氨基酸一致性均為100%。與其他種屬動(dòng)物的IL-4基因氨基酸的一致性則較低，為 37.2%～82.7%，其中與牛（M77120)最高，為82.7%，其余依次綿羊(NM_001009313)80.8%、狗（AF239917）76.9%、 貓 (U39634) 和 馬（JQ432546）74.4%、 智 人 (AM937235)60.9%、 人（M13982）55.9%、 鼠（M25892)44.9%，與鴨(XM_005024359)最低，為37.2%。

2.5 IL-4基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)

應(yīng)用MEGA5.0軟件，分別將Genebank中已發(fā)表的IL-4序列按豬源、豬與其他種屬動(dòng)物進(jìn)行比較、繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖4、圖5。從豬源IL-4基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)中，可知除貴州白香豬與L12991的IL-4遺傳距離稍遠(yuǎn)位于不同的進(jìn)化分支外，與其余豬源IL-4基因均位于同一進(jìn)化分支，彼此親緣關(guān)系較近。此外，貴州白香豬IL-4基因遺傳距離與牛、羊、狗的親緣關(guān)系較近，而與鼠和鴨的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明IL-4存在明顯種屬差異性。

3 討論

細(xì)胞因子作為免疫增強(qiáng)劑的研究已成為免疫佐劑研究的一個(gè)新方向。IL-4是機(jī)體體液免疫的重要調(diào)節(jié)因子，對(duì)免疫應(yīng)答的影響主要是抑制細(xì)胞免疫，促進(jìn)體液免疫(特別是IgE反應(yīng))，增強(qiáng)特異性和非特異性的殺傷功能[8]。IL-4在免疫方面的調(diào)節(jié)功能，有利于新型疫苗佐劑的研究和病毒性疫病的防治。序列分析結(jié)果表明，豬源IL-4基因在進(jìn)化中較為保守，彼此親緣關(guān)系較近，具有明顯的同源性，表明豬種的不同不會(huì)使IL-4出現(xiàn)明顯差異，同一物種IL-4基因具有極高的保守性。與其他物種的IL-4相比，豬IL-4基因與家畜如牛、羊、馬遺傳距離較近；而與鼠，鴨的遺傳距離較遠(yuǎn)，表明IL-4存在種屬差異性。

試驗(yàn)首次擴(kuò)增克隆了貴州白香豬IL-4基因，這為進(jìn)一步研究貴州白香豬IL-4在體內(nèi)外的作用，并為研究其生理活性及在疾病和疫苗免疫中的作用提供了條件。同時(shí)貴州白香豬IL-的深入研究，也可以為豬源器官移植供體的研究提供參考。

[1] 胡洪慧，王鳳山，凌沛學(xué). 白細(xì)胞介素-4的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40(10): 721-725.

[2] Oleksowicz L, Dutcher J P. A Review of the New Cytokines: IL-4, IL-6, IL-11, and IL-12[J]. Am J Ther， 1994, 1(2):107-115.

[3] 李軍，熊艷蕓，梁湘，等. 廣西巴馬小型豬IL-4和IL-10基因的克隆和序列分析[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26(10): 73-77.

[4] Wondimu A, Veit M, Kohn B, et al. Molecular cloning, expression and characterization of the Canis familiaris interleukin-4[J]. Cytokine， 2001, 16(3):88-92.

[5] 李惠，高榮，武梅，等. 藏豬白細(xì)胞介素4基因cDNA的克隆及序列分析[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志， 2003(7): 475-478.

[6] 曾智勇，周莉，劉志杰，等. 貴州白香豬的白細(xì)胞介素2基因的克隆及其序列分析[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012，40(5):122-125.

[7] 曾智勇，周莉，劉志杰，等. 貴州白香豬γ干擾素基因的克隆與序列分析[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012，40(8): 151-153.

[8] 武梅，高榮，李江凌，等. 成華豬淋巴細(xì)胞白細(xì)胞介素-4基因的克隆及序列分析[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科技，2002，32(8): 8-11.