蜂毒多肽對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

王 強(qiáng)，劉艷如，陳宇東，王領(lǐng)軍，劉同偉，李春吾，苑海波

蜂毒多肽是蜜蜂毒素的主要成分，具有多種生物活性，有研究報(bào)道蜂毒多肽在體外對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用［1-2］。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，早期手術(shù)以及隨后的放療、化療對(duì)身體傷害較大，患者生存率低，因此對(duì)其發(fā)生機(jī)制的研究及治療新藥物的研發(fā)是解決膀胱癌臨床治療的根本途徑［3-7］。我們通過(guò)人膀胱癌T24細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)及裸鼠移植瘤模型，觀察及探討蜂毒多肽對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及裸鼠膀胱癌細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 蜂毒多肽(Sigma公司，美國(guó))，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)和四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Amresco公司，美國(guó))，Annexin V-FITC凋亡試劑盒(晶美公司)，流式細(xì)胞儀(Beckon Dickenson公司，美國(guó))。

1.2 細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng) 人膀胱癌細(xì)胞株T24引自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，置于37℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，0．2%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 MTT檢測(cè)蜂毒多肽對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2．5×104/ml，每孔200μl接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，設(shè)不加藥的空白對(duì)照組及蜂毒多肽組，蜂毒多肽組分別加入終濃度為1、10、100 mg/ml的蜂毒多肽，各設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別在12、24和48 h后吸去上清，加入80μl含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液和5 g/L MTT溶液20μl，培養(yǎng)4 h后加入150μl DMSO，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值(A)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=1－(實(shí)驗(yàn)組 A值/對(duì)照組 A值)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡選擇48 h各組細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，收集細(xì)胞用70%冷乙醇固定，4℃保存過(guò)夜。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，取1 ml細(xì)胞懸液，用PBS洗3次，加入10 g/L RNA酶溶液200μl，37℃水浴15 min，按試劑盒說(shuō)明先加AnnexinV-FTTC液10μl孵育，再加入碘化丙錠10μl(終濃度為5 g/L)，室溫避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.5 Transwell小室法測(cè)定細(xì)胞侵襲力 將2×105/ml單細(xì)胞懸液加入侵襲小室上層，各組進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，48 h后取出侵襲小室，棉簽擦凈侵襲小室上室面的人工基質(zhì)膠和細(xì)胞，PBS漂洗5 min，重復(fù)3次，福爾馬林固定30 min后，蘇木素輕度染色，無(wú)水酒精脫水，環(huán)割取下侵襲小室膜，細(xì)胞面朝上浸于二甲苯中透明2 min，在載玻片上滴一滴中性樹(shù)脂，取出侵襲膜，細(xì)胞面朝上置于樹(shù)脂中，再滴一滴中性樹(shù)脂，蓋玻片封片。細(xì)胞侵襲力測(cè)定:200倍光鏡下取上、下、左、右、中心5個(gè)視野，記錄膜下室面的細(xì)胞數(shù)，取均數(shù)，平均細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞侵襲力。

1.6 裸鼠分組及皮下移植瘤模型 28只SPF級(jí)BALB/C雌性裸鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，15～20 g重，5～7周齡，飼養(yǎng)于超凈生物層流架內(nèi)，定期紫外線消毒，滅菌處理水和飼料供動(dòng)物自由攝入，動(dòng)物房溫度在23～25℃，濕度在40% ～60%，實(shí)驗(yàn)操作均在無(wú)菌罩內(nèi)進(jìn)行。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞，用PBS制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整活細(xì)胞濃度為2×107/ml，每只裸鼠背部接種上述單細(xì)胞懸液0．2 ml，成瘤后將荷瘤裸鼠隨機(jī)分4組，每組7只。蜂毒多肽低劑量組、中劑量組和高劑量組注入蜂毒多肽濃度分別為1 mg/kg、5 mg/kg和25 mg/kg，腹腔注射，1/d，連續(xù)治療15 d，對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.7 膀胱癌細(xì)胞裸鼠移植瘤體積測(cè)量、血液常規(guī)肝腎功能檢測(cè) 每5天用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次裸鼠腫瘤最大長(zhǎng)徑(L)和最大橫徑(S)，腫瘤體積按0．5×L×S2計(jì)算，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，計(jì)算體積抑瘤率(抑瘤率=1－給藥組體積/對(duì)照組體積)。第15天抽裸鼠尾靜脈血測(cè)肝腎功能和血常規(guī)，血常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)為白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)，肝功能檢測(cè)指標(biāo)為谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，腎功能檢測(cè)指標(biāo)為尿素氮(BUN)。

2 結(jié)果

2.1 蜂毒多肽對(duì)T24細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 隨著蜂毒多肽濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，T24細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，具有時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 蜂毒多肽對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖影響的吸光度檢測(cè)(±s)

表1 蜂毒多肽對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖影響的吸光度檢測(cè)(±s)

注:對(duì)照組為注射等量生理鹽水;與對(duì)照組比較，a P＜0.05，b P＜0.01，與蜂毒多肽 1 mg/ml組比較，c P ＜0.05，d P＜0.01，與蜂毒多肽10 mg/ml組比較，f P＜0.01

組別 劑量(mg/ml)孔數(shù)12 h 24 h 48 h對(duì)照組 － 6 0．568 ±0．057 0．789 ±0．064 0．912 ±0．111蜂毒多肽組 1 6 0．512±0．044 0．714 ±0．061 0．847±0．105 10 6 0．422±0．034a 0．598 ±0．055bc 0．715±0．055bc 100 6 0．302±0．029bdf 0．425 ±0．066bdf 0．526±0．051 bdf

表2 蜂毒多肽對(duì)膀胱癌細(xì)胞抑制率(%)

2.2 蜂毒多肽對(duì)T24細(xì)胞周期和凋亡的影響 作用48 h時(shí)，隨著蜂毒多肽濃度增加，膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，細(xì)胞阻滯于G0/G1期，細(xì)胞凋亡率顯著升高，具有劑量效應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 細(xì)胞侵襲力測(cè)定結(jié)果 作用48 h時(shí)，隨著蜂毒多肽濃度增加，細(xì)胞侵襲力顯著下降，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 蜂毒多肽對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期及凋亡率影響的檢測(cè)(±s)

表3 蜂毒多肽對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期及凋亡率影響的檢測(cè)(±s)

注:對(duì)照組注射等量生理鹽水;與對(duì)照組比較，b P＜0．01;與蜂毒多肽1 mg/ml組比較，d P＜0．01;與蜂毒多肽10 mg/ml組比較，f P ＜0．01

組別 劑量(mg/ml) 孔數(shù) G0/G1(%) S(%) G2/M(%) 凋亡率(%) 細(xì)胞侵襲力(個(gè)/視野)對(duì)照組 － 6 46．2±4．6 34．2±3．3 18．2±2．1 4．2 ±0．3 162．4±13．5蜂毒多肽組 1 6 49．5 ±5．2 32．2 ±3．2 17．2 ±2．0 6．3 ±0．6b 101．4 ±10．5 10 6 62．7 ±5．2bd 23．7 ±2．7bd 14．9 ±1．5bd 11．2 ±2．3bd 68．5 ±7．9bd 100 6 79．2 ±6．9bdf 14．8 ±2．2bdf 11．1 ±1．2bdf 17．6 ±3．7bdf 25．4 ±2．7 bdf

2.4 蜂毒多肽對(duì)裸鼠的抑瘤效應(yīng) 蜂毒多肽低劑量組、中劑量組和高劑量組的腫瘤體積呈降低趨勢(shì)，具有藥物作用劑量的效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表4、5。

2.5 荷瘤裸鼠血常規(guī)及肝腎功能檢測(cè)結(jié)果 蜂毒多肽組血常規(guī)及肝腎功能與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 蜂毒多肽荷瘤裸鼠抑瘤率檢測(cè)結(jié)果(%)

表5 荷瘤裸鼠腫瘤體積檢測(cè)結(jié)果(mm3，±s)

表5 荷瘤裸鼠腫瘤體積檢測(cè)結(jié)果(mm3，±s)

0 d 5 d 10 d 15 d對(duì)照組 － 7 143．1 ±12．4 369．7 ±30．1 555．4 ±44．1 600．7 ±5組別 劑量(mg/ml) 只數(shù)5．2蜂毒多肽低劑量組 1 7 144．7 ±12．5 344．7 ±29．8 494．7 ±42．1 552．9 ±46．8蜂毒多肽中劑量組 5 7 142．8 ±11．9 284．4 ±28．0bd 355．4 ±29．5bd 422．8 ±42．7bd蜂毒多肽高劑量組 25 7 140．1 ±12．5 214．4 ±22．2bdf 255．7 ±26．3bdf 303．6 ±27．4 bdf

注:對(duì)照組注射等量生理鹽水;與對(duì)照組比較，bP＜0．01;與蜂毒多肽低劑量組比較，dP＜0．01;與蜂毒多肽中劑量組比較，fP ＜0．01

表6 荷瘤裸鼠血常規(guī)及肝腎功能指標(biāo)比較(±s)

表6 荷瘤裸鼠血常規(guī)及肝腎功能指標(biāo)比較(±s)

注:對(duì)照組注射等量生理鹽水

組別 劑量(mg/ml) 只數(shù) 白細(xì)胞(×109/L)紅細(xì)胞(×1012/L)血紅蛋白(g/L)血小板(×109/L)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(U/L)尿素氮(μmol/L)對(duì)照組 － 7 5．10 ±1．14 6．68 ±0．35 139．20 ±13．81 428．66 ±111．28 98．80 ±42．58 13．20 ±3．68蜂毒多肽低劑量組 1 7 4．75 ±1．45 6．78 ±0．48 145．20 ±12．62 436．12 ±101．36 101．20 ±38．46 12．60 ±4．28蜂毒多肽中劑量組 5 7 4．78 ±1．34 6．56 ±0．52 142．20 ±13．83 426．68 ±110．62 97．60 ±44．82 13．82 ±4．18蜂毒多肽高劑量組 25 7 4．86 ±1．44 6．74 ±0．56 136．20 ±15．21 408．98±119．68 99．48 ±47．52 14．12 ±3．38

3 討論

蜂毒是工蜂毒腺和附腺分泌出的一種具有芳香氣味的透明毒液，在我國(guó)，傳統(tǒng)中醫(yī)以蜂毒入藥治病有著悠久的歷史。蜂毒的化學(xué)成分比較復(fù)雜，其主要活性物質(zhì)是蜂毒多肽，主要由蜂毒肽、蜂毒明肽、含組胺肽、磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶等成分組成，約占干蜂毒的50%［8］?，F(xiàn)代藥理研究表明它具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制血小板凝集、抗艾滋病及抗腫瘤等多種作用［9］。近年來(lái)蜂毒多肽所具有的抗腫瘤活性引起大量研究者的關(guān)注，研究認(rèn)為蜂毒多肽能夠溶解細(xì)胞線粒體膜，抑制細(xì)胞的正常呼吸，使腫瘤組織氧化與磷酸化的過(guò)程受到抑制，破壞其氧化功能，從而抑制腫瘤組織生長(zhǎng)［10-11］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察蜂毒多肽對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示，隨著蜂毒多肽濃度從1 mg/ml增加到100 mg/ml，作用時(shí)間從12 h到48 h，T24細(xì)胞的體外生長(zhǎng)受到明顯抑制，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著升高，具有藥物作用劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。蜂毒多肽組裸鼠移植瘤體積顯著小于對(duì)照組，隨蜂毒多肽濃度增加，腫瘤生長(zhǎng)抑制率顯著升高，表明蜂毒多肽可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，證實(shí)了蜂毒多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)及體外均具有顯著殺傷、抑制作用。

細(xì)胞的增殖與凋亡失衡是腫瘤形成和發(fā)展的重要機(jī)制，該過(guò)程涉及多個(gè)基因的改變，并受復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)節(jié)［12］。膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)是一個(gè)多基因參與、經(jīng)歷多步驟的復(fù)雜過(guò)程，這些基因功能涉及細(xì)胞增殖、分化和衰老及凋亡等基本生命過(guò)程的調(diào)控［13-14］，其中，細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的一種主動(dòng)性細(xì)胞自殺過(guò)程，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和消退有密切關(guān)系，具有獨(dú)特的生化和形態(tài)特征［15］。膀胱癌細(xì)胞的發(fā)生不僅與細(xì)胞增殖失控有關(guān)，也與凋亡的減少有密切關(guān)系［16］。本研究顯示隨著蜂毒多肽濃度增加，膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，細(xì)胞阻滯于G0/G1期，細(xì)胞凋亡率顯著升高，100 mg/ml蜂毒多肽作用48 h時(shí)，細(xì)胞凋亡率較高，說(shuō)明蜂毒多肽體外可誘導(dǎo)T24膀胱癌細(xì)胞發(fā)生凋亡來(lái)產(chǎn)生抗腫瘤活性。根據(jù)本研究及多種體外實(shí)驗(yàn)推測(cè)蜂毒多肽很可能是通過(guò)影響G1期周期調(diào)節(jié)因子的活性而發(fā)揮周期調(diào)控作用的［17］。我們同時(shí)可以觀察到，隨著蜂毒多肽濃度增加，膀胱癌細(xì)胞侵襲力顯著下降，具有藥物作用劑量依賴性，表明蜂毒多肽可通過(guò)抗侵襲機(jī)制來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散。蜂毒多肽誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的具體途徑可能與細(xì)胞的類(lèi)型、狀態(tài)、信號(hào)途徑中的各個(gè)效應(yīng)器的活性及功能有關(guān)，有待進(jìn)一步的研究。

蜂毒多肽在體內(nèi)大劑量應(yīng)用易產(chǎn)生溶血等副作用，而小劑量副作用雖減輕，但其抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)也相應(yīng)減弱［18-19］，這成為限制其臨床應(yīng)用的主要障礙之一，至今未見(jiàn)有用于治療腫瘤的臨床報(bào)道［20］。天然的蜂毒成分復(fù)雜，含有十余種生物活性肽，以及五十多種酶類(lèi)物質(zhì)，而蜂毒多肽的分子結(jié)構(gòu)中有3個(gè)賴氨酸和2個(gè)精氨酸殘基使其成為一種強(qiáng)堿性肽［21］。其溶血副作用主要是通過(guò)裂解細(xì)胞膜完成的，深入研究其構(gòu)效關(guān)系，通過(guò)結(jié)構(gòu)改造不但可減低溶血等副作用，還可使抗腫瘤作用大大加強(qiáng)［22-23］。有研究認(rèn)為在體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)蜂毒多肽的溶血及細(xì)胞毒等副作用，可能與藥物主要作用于腫瘤細(xì)胞及分布在腫瘤組織，全身濃度較低有關(guān)［24］。因此，蜂毒多肽通過(guò)結(jié)構(gòu)改造的新型制劑的應(yīng)用既避免了體內(nèi)溶血及細(xì)胞毒等副作用，又可抑制腫瘤生長(zhǎng)，為蜂毒多肽在臨床的劑量確定及作用機(jī)制提供了依據(jù)［19］。

蜂毒多肽對(duì)體外多種實(shí)驗(yàn)性腫瘤具有殺傷作用，在治療惡性腫瘤方面有一定的臨床應(yīng)用前景，關(guān)于蜂毒多肽及其新劑型的抗腫瘤作用機(jī)制及最佳作用濃度有待進(jìn)一步的深入研究，當(dāng)然其潛在的細(xì)胞毒副作用亦不容忽視，使蜂毒多肽成為一種低毒有效的新型抗癌藥物應(yīng)用于臨床是下一步研究的重點(diǎn)。

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