TLR4和NF-κB在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

陳 佳，余宏鑄，王正林，張曉亮

TLR4和NF-κB在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

陳 佳1，余宏鑄1，王正林1，張曉亮2

目的探討Toll樣受體4（TLR4）和核因子κB（NF-κB）在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法收集110例膽管病理組織蠟塊，包括40例肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織、40例肝內(nèi)膽管結(jié)石旁膽管組織和30例正常肝內(nèi)膽管組織（肝血管瘤旁正常膽管組織或者肝外傷后切除肝組織的正常膽管組織），采用免疫組織化學(xué)（PV）法檢測(cè)各組織中TLR4和NF-κB的表達(dá)情況并分析結(jié)果。結(jié)果肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中的TLR4和NF-κB表達(dá)量明顯高于肝內(nèi)膽管結(jié)石旁膽管組織和正常肝內(nèi)膽管組織（P＜0.05）。在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中TLR4和NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.709）。TLR4和NF-κB的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論TLR4和NF-κB的表達(dá)與肝內(nèi)膽管結(jié)石到肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的逐步發(fā)展具有密切相關(guān)性，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)。

膽管細(xì)胞癌；TLR4；NF-κB；肝內(nèi)膽管結(jié)石

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌是來(lái)自于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。有研究［1］表明，肝內(nèi)膽管結(jié)石與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的發(fā)生具有密切關(guān)系，但是由于在臨床上缺乏特異性的癥狀、體征以及檢查依據(jù)，以至于肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的早期診斷一直較困難。脂多糖（lipopolysacoharides，LPS）-Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）-核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前發(fā)現(xiàn)的重要的炎性通路之一，已有研究［2］表明NF-κB在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中呈現(xiàn)過(guò)度表達(dá)，但是沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道TLR4在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)情況以及TLR4和NF-κB的相關(guān)性分析。該研究通過(guò)免疫組織化學(xué)（PV）法檢測(cè)TLR4和NF-κB在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織、肝內(nèi)膽管結(jié)石旁膽管組織和正常肝內(nèi)膽管組織（肝血管瘤旁正常膽管組織或者肝外傷后切除肝組織的正常膽管組織）中的表達(dá)情況，并分析其相關(guān)性與臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2003年1月～2013年1月與本課題相關(guān)的110例肝內(nèi)膽管組織蠟塊標(biāo)本，分為3組：Ⅰ組為40例肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織；Ⅱ組為40例肝內(nèi)膽管結(jié)石旁膽管組織；Ⅲ組為30例正常肝內(nèi)膽管組織（肝血管瘤旁正常膽管組織或者肝外傷后切除肝組織的正常膽管組織）。Ⅰ組在術(shù)前未接受過(guò)任何放療、化療和抗炎治療。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片 將病理科切取的石蠟切片放置于98℃烤片機(jī)中20 min，經(jīng)二甲苯兩次脫蠟，再經(jīng)由高到低的3種梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗后待用。

1.2.2 抗原微波修復(fù)及處理 將切片置于檸檬酸鹽緩沖液中，放于微波爐中加熱20 min，取出冷卻。3%H2O2去離子水室溫下孵育15 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3 min×3次。滴加一抗（TLR4的一抗工作濃度為1∶120，NF-κB的一抗工作濃度為1∶100），4℃冰箱過(guò)夜。第2天取出后置于37℃溫箱復(fù)溫40 min，PBS沖洗3 min×3次。滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，37℃溫箱孵育20 min，PBS沖洗3 min×3次。

1.2.3 顯色和封片 應(yīng)用DAB顯色液顯色，約5 min后置于水中終止反應(yīng)。蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明封片。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，試劑商提供的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)采用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。其中TLR4表達(dá)于膽管細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，NF-κB表達(dá)于膽管細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。染色結(jié)果判斷采用半定量方法。首先根據(jù)染色強(qiáng)度打分：細(xì)胞無(wú)染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。再次根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占細(xì)胞的百分比：陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞占總數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為4分。依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性百分比分值相乘結(jié)果分為4個(gè)等級(jí)：0 ～2分為“－”，3～4分為“＋”，5～8分為“?”，9～12分為“?”?！?分則為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)檢測(cè)組間差異以及P值，相關(guān)性分析則采用χ2檢驗(yàn)及其列聯(lián)系數(shù)法分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組標(biāo)本組織中的TLR4和NF-κB表達(dá)水平比較①TLR4表達(dá)：鏡下可見(jiàn)膽管細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)棕黃褐色均質(zhì)和顆粒，肝細(xì)胞顯示強(qiáng)陽(yáng)性，見(jiàn)圖1A1、B1、C1）。通過(guò)表1分析可得Ⅰ組和Ⅱ組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.381，P＜0.05）；Ⅱ組和Ⅲ組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.715，P＜0.05）；Ⅰ組和Ⅲ組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝16.138，P＜0.01）；由上可知TLR4在3組中的表達(dá)強(qiáng)弱為Ⅰ組＞Ⅱ組＞Ⅲ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②NF-κB表達(dá)：鏡下可見(jiàn)膽管細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)棕黃褐色均質(zhì)和顆粒，肝細(xì)胞顯示強(qiáng)陽(yáng)性，見(jiàn)圖1A2、 B2、C2。通過(guò)表1分析可得Ⅰ組和Ⅱ組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.114，P＜0.05）；Ⅱ組和Ⅲ組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.755，P＜0.05）；Ⅰ組和Ⅲ組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝15.522，P ＜0.01）；由上可知NF-κB在3組中的表達(dá)強(qiáng)弱為Ⅰ組＞Ⅱ組＞Ⅲ組。

圖1 TLR4和NF-κB在3組不同膽管組織中的表達(dá) PV×200

表1 3組標(biāo)本組織中的TLR4和NF-κB表達(dá)水平比較（n）

2.2 腫瘤組織標(biāo)本中的TLR4和NF-κB的相關(guān)性分析利用統(tǒng)計(jì)學(xué)χ2檢驗(yàn)及其列聯(lián)系數(shù)法分析腫瘤組織標(biāo)本中的TLR4和NF-κB的表達(dá)情況，結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)（χ2＝20.09，P＜0.01，r＝0.709），見(jiàn)表2。

表2 腫瘤組織標(biāo)本中的TLR4和NF-κB的相關(guān)性分析（n）

2.3 肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中TLR4和NF-κB的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系得出TLR4和NF-κB的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中TLR4和NF-κB的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的發(fā)病率約為消化系統(tǒng)腫瘤的3%［3］，而其中肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的發(fā)病率約為整個(gè)膽管癌的5%～10%［4］，而近年來(lái)的發(fā)病率依舊處于上升趨勢(shì)［5］。肝內(nèi)膽管可因結(jié)石的梗阻、膽汁淤積而反復(fù)的發(fā)生細(xì)菌感染，導(dǎo)致膽道系統(tǒng)內(nèi)慢性炎癥環(huán)境的持續(xù)存在，是肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞癌變的主要誘因［6］。炎癥是機(jī)體對(duì)于外界感染刺激所做出的有益的回應(yīng)，是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，但同時(shí)慢性反復(fù)的炎性刺激又與癌癥的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)聯(lián)［7－9］。Sheen-Chen et al［10］發(fā)現(xiàn)膽道感染的細(xì)菌譜主要是革蘭陰性菌，如大腸桿菌、克雷伯桿菌等，而革蘭陰性菌的外壁層中具有一種特別的化學(xué)成分LPS，而LPS則是介導(dǎo)TLR4產(chǎn)生應(yīng)答的主要配體。

TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)Toll樣受體蛋白。Toll樣受體是一類病原識(shí)別受體，可感受入侵的病原微生物，主要存在于免疫細(xì)胞。而近年的研究［11］也表明其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有不可分割的聯(lián)系，如腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。TLR配體可刺激炎癥分子，尤其是NF-κB的活性，從而最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，其中TLR4是介導(dǎo)內(nèi)毒素／LPS應(yīng)答的最重要受體。當(dāng)TLR4與相應(yīng)配體結(jié)合后會(huì)將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至翻譯起始區(qū)（TIR區(qū)域），然后進(jìn)一步激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路，從而促進(jìn)各種炎性細(xì)胞基因表達(dá)。

NF-κB在靜息情況下以同源或者異源二聚體的形式與細(xì)胞質(zhì)抑制蛋白結(jié)合形成復(fù)合物［12］，當(dāng)細(xì)胞受到外來(lái)的刺激時(shí)，復(fù)合物解離，NF-κB則會(huì)由胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至核內(nèi)發(fā)揮其調(diào)控作用。NF-κB作為慢性刺激與癌變關(guān)系演變中的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)，在多種腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲調(diào)控中發(fā)揮重要作用。目前研究［2］表明，NF-κB在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中呈過(guò)表達(dá)，其上調(diào)多種細(xì)胞因子（抗凋亡蛋白及白細(xì)胞介素6等）的表達(dá)，阻止細(xì)胞的正常凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的增殖等從而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。因此研究TLR4通路的阻斷和抑制的方法也成為了目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)課題之一。

關(guān)于LPS-TLR4-NF-κB轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，已知是目前發(fā)現(xiàn)的重要的炎性通路之一，其轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程與許多疾病以及腫瘤的發(fā)生及發(fā)展具有密切聯(lián)系，其下游的炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)式反應(yīng)的表達(dá)不同也常會(huì)使得疾病的轉(zhuǎn)歸不同。

本研究中TLR4和NF-κB分別在3組中的表達(dá)均逐漸衰減，且在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)分析可得兩種因子在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織的表達(dá)呈正相關(guān)，由此推測(cè)LPS-TLR4-NF-κB通路在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌發(fā)生中的作用，有利于肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌臨床早期的預(yù)防和診斷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為下一步尋找特異性的標(biāo)志物檢測(cè)肝內(nèi)膽管結(jié)石患者是否并發(fā)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌提供了理論依據(jù)，為研究該通路中關(guān)鍵分子的抑制物從而預(yù)防肝內(nèi)膽管結(jié)石患者的膽管上皮細(xì)胞癌變提供了理論依據(jù)。通過(guò)對(duì)臨床相關(guān)的病理參數(shù)的研究表明，肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中TLR4和NF-κB的表達(dá)在性別、年齡、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移的組間比較，差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中LPS-TLR4-NF-κB通路在腫瘤的逐步發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色，而與腫瘤本身的特性無(wú)關(guān)。

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Expression and clinical significance of NF-κB and TLR4 in
intrahepatic lithiasis associated with intrahepatic cholangiocarcinoma

Chen Jia，Yu Hongzhu，Wang Zhenglin，et al
（Dept of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the expressions and clinical significance of NF-κB and TLR4 in intrahepatic lithiasis associated with intrahepatic cholangiocarcinoma.MethodsCollect bile duct histopathologic wax blocks of liver tissues specimen of hepatectomy which were selected in department of pathology of the first affiliated hospital of Anhui medical university in recent 10 years，including 40 cases of intrahepatic bile duct calculi of intrahepatic bile duct carcinoma tissue，40 cases of intrahepatic biliary calculi by bile duct tissues and 30 cases of normal bile duct tissues（normal bile duct tissues adjacent to liver hemangioma or liver trauma after resection of liver tissue of normal bile duct tissues）.Immune histochemical method（PV）was tested in organizations in NF-κB and the expression of TLR4 and results were analyzed.ResultsThe amount of NF-κB and TLR4 expression in intrahepatic biliary calculi of intrahepatic bile duct carcinoma tissue was significantly higher than that in the intrahepatic bile duct stones near bile duct tissues and normal bile duct tissue（P＜0.05）.The expression of TLR4 and NF-κB in intrahepatic biliary calculi of intrahepatic bile duct carcinoma was correlative and presents positive correlation（r＝0.709）.The comparison between groups of patients′age，sex，tumor differentiation，tumor invasion and lymph node metastasis that related the expression of TLR4 and NF-κB showed that there was no statistically significant difference（P＞0.05）.ConclusionThe abnormal expression of TLR4 and NF-κB is closely associated with the gradual progress of intrahepatic bile duct stones complicated with intrahepatic bile duct carcinoma，and both are positively correlated.

cholangiocarcinoma；TLR4；NF-κB；intrahepatic

R 735.8

1000－1492（2014）05－0625－04

2014－02－25接收

2013年安徽省年度重點(diǎn)科研項(xiàng)目（編號(hào)：1301043034）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科，合肥 230022

2安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥 230032

陳 佳，男，碩士研究生；

余宏鑄，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hongzhu.620929＠aliyun.com