急性冠脈綜合征患者外周血CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細胞的變化及意義

徐林杰，吳繼雄，許邦龍，王曉晨，彭曉云，何非

急性冠脈綜合征患者外周血CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細胞的變化及意義

徐林杰，吳繼雄，許邦龍，王曉晨，彭曉云，何非

目的探討急性冠脈綜合征（ACS）患者外周血CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的變化及意義。方法收集行冠狀動脈造影檢查的住院患者96例，按照1979年WHO冠心病診斷和分型標準，將患者分為3組：ACS 組48例、穩(wěn)定性心絞痛（SAP）組24例、正常對照組24例。采用流式細胞術(shù)檢測各組患者外周血CD4＋CD25＋CD127lowTreg細胞水平，同時檢測并比較各組患者超敏C反應蛋白（hs-CRP）、外周血白細胞（PWBC）計數(shù)水平。結(jié)果ACS組外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細胞比例［（3.18± 1.76）%］顯著低于正常對照組［（5.64±1.63）%］和SAP組［（5.60±1.56）%］（F＝25.247，P＜0.01），而ACS組外周血hs-CRP、PWBC計數(shù)水平明顯高于正常對照組和SAP組（P＜0.05）。此外，患者外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細胞比例的下降與hs-CRP和PWBC計數(shù)的升高呈負相關(guān)（r分別為－0.518、－0.311，P＜0.01）。結(jié)論ACS患者外周血中Treg細胞比例的下降可能通過破壞外周免疫耐受平衡和激活炎癥反應參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。

急性冠脈綜合征；調(diào)節(jié)性T細胞；超敏C反應蛋白；白細胞；流式細胞術(shù)

隨著人們生活水平的不斷提高，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年上升。急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）發(fā)病急、病情危重、死亡率高，是臨床常見的心血管急重癥，包括不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina，UA）和急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）［1］。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是其主要的病理性基礎，目前認為AS是一種慢性炎癥性疾病，免疫細胞尤其是CD4＋T細胞在其中發(fā)揮重要作用。調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg細胞）是一組特殊的具有免疫負調(diào)節(jié)功能的CD4＋T細胞亞群，在AS和ACS發(fā)生、發(fā)展的各個階段均發(fā)揮著重要的作用。近年來相關(guān)研究［2］表明ACS患者外周血CD4＋CD25＋Treg細胞數(shù)量減少。CD127作為Treg細胞新的表面標志物，在ACS中的研究較少，因此通過標記CD127，采用流式細胞儀檢測ACS組、穩(wěn)定性心絞痛（stable angina pectoris，SAP）組和正常對照組外周血CD4＋CD25＋CD127lowTreg細胞水平的變化，及其與超敏C反應蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、外周血白細胞（peripheral white blood cell，PWBC）計數(shù)之間的關(guān)系，探討免疫調(diào)節(jié)因素在ACS中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集2012年8月～2013年6月在安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科行冠狀動脈造影等檢查的住院患者96例，按照1979年WHO冠心病診斷和分型標準，其中ACS組48例，包括AMI 18例和UA 30例；SAP組24例；經(jīng)臨床癥狀、心電圖、經(jīng)胸心臟彩色多普勒超聲、冠狀動脈造影檢查排除其他器質(zhì)性心臟疾病的正常對照組24例。所有患者均排除腫瘤、感染、自身免疫性疾病、嚴重肝腎疾病、血液系統(tǒng)疾病及近期服用免疫抑制劑。

1.2 試劑與儀器藻紅蛋白（PE）標記的抗人CD127單抗（克隆號hiL-7R-M21）、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的小鼠抗人CD25單抗（克隆號U7.27）和PE-Cy5-CD4同型陰性對照試劑購自美國Beckman-Coulter公司；溶血劑為0.83%的氯化銨溶液，由安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院血液病實驗室用去離子蒸餾水自行配制。流式細胞儀為美國Beckman-Coulter公司FC500系列，熒光激發(fā)光波長為488 nm 和633 nm，分析軟件為CXP系統(tǒng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清生化檢測 所有患者常規(guī)檢測血常規(guī)、肝腎功能、血糖、血脂，同時采用免疫散射比濁法測定hs-CRP。

1.3.2 流式細胞儀檢測Treg細胞的百分率 患者均于夜間禁食12 h后清晨空腹平臥位、嚴格無菌操作采集肘靜脈血2 ml，肝素抗凝，4 h內(nèi)送檢血液病學實驗室行流式細胞儀檢測。檢測時首先根據(jù)前向（FSC）和側(cè)向（SSC）散射光信號對淋巴細胞群進行設門，每份標本獲取設門內(nèi)細胞在10 000個以上。將收集的全血1 500 r／min離心5 min，棄上清液，留取沉淀細胞并打散，加入PBS，再反復離心洗滌3次，制成細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)為（1～6）×106／ml。采用三色直接免疫熒光標記法：首先取2支試管分別加入抗凝全血100 μl，其中一管加入CD25-FITC、CD127-PE以及CD4-PC5-Cy5單抗各10 μl，另一管則作為對照管加入CD4-PC5-Cy5、FITC-IgG1和各單抗相對應的同型對照PE 10 μl，充分混勻后室溫下避光孵育15 min，加入1 ml溶血劑，37℃水浴箱內(nèi)放置10 min左右，待完全溶血后立刻上流式細胞儀檢測，檢測后數(shù)據(jù)以Listmode文件形式保存。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗的計量資料多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），進一步兩兩比較采用LSD檢驗，計數(shù)資料間比較采用χ2檢驗，部分指標采用Pearson直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組一般臨床資料的比較各組年齡、性別、吸煙、高血壓、空腹血糖（Glu）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-c）等冠心病危險因素的比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。ACS組和SAP組高密度脂蛋白（HDL）水平明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而ACS組和SAP組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組外周血Treg細胞檢測的比較ACS組外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細胞比例明顯低

圖1 各組Treg細胞的流式檢測圖

表1 各組一般情況（±s）

表1 各組一般情況（±s）

與正常對照組比較：※※P＜0.01

項目正常對照組（n＝24）SAP組（n＝24）ACS組（n＝48）F／χ2值P值男／女（例）15／915／934／140.7500.687高血壓（例）915304.5710.102糖尿?。ɡ?15300.6430.725吸煙（例）815185.2360.073年齡（歲）58.63±10.3456.88±9.0961.77±10.192.1370.124 Glu（mmol／L）5.50±0.665.73±0.525.60±1.180.3500.706 TC（mmol／L）3.86±0.843.99±1.213.62±1.061.1190.331 TG（mmol／L）1.14±0.451.09±0.520.91±0.601.6910.190 LDL-c（mmol／L）2.43±0.592.32±1.052.41±0.870.1440.866 HDL（mmol／L）1.30±0.320.84±0.41※※0.91±0.35※※11.8940.000

于正常對照組和SAP組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），SAP組外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細胞比例與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），見表2、圖1。ACS組外周血Treg細胞／CD4＋CD25＋CD127high比值低于正常對照組（P＜0.01），而SAP組和正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組外周血流式細胞儀檢測結(jié)果（±s）

表2 各組外周血流式細胞儀檢測結(jié)果（±s）

與正常對照組比較：※※P＜0.01；與SAP組比較：＃＃P＜0.01

項目正常對照組（n＝24）SAP組（n＝24）ACS組（n＝48）F值P值CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細胞比例（%）25.247 0.000 CD4＋CD25＋CD127high占CD4＋細胞比例（%）5.64±1.635.60±1.56 3.18±1.76※※＃＃5.41±2.015.40±2.24 5.69±1.810.243 0.785 Treg細胞／CD4＋CD25＋CD127high1.30±0.601.07±0.41 0.94±0.34※※5.644 0.005

2.3 各組外周血hs-CRP、PWBC計數(shù)比較統(tǒng)計結(jié)果顯示：ACS組hs-CRP、PWBC計數(shù)均明顯高于正常對照組和SAP組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），SAP組中PWBC計數(shù)與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），hs-CRP水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組外周血hs-CRP、PWBC計數(shù)的比較（±s）

表3 各組外周血hs-CRP、PWBC計數(shù)的比較（±s）

與正常對照組比較：※※P＜0.01；與SAP組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

項目正常對照組（n＝24）SAP組（n＝24）ACS組（n＝48）F值P值hs-CRP（mg／L）2.82±2.863.14±3.047.36±1.77※※＃＃39.140 0.000 PWBC（×109／L）5.54±1.126.86±0.77※※7.65±1.63※※＃19.696 0.000

2.4 CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細胞比例與hs-CRP、PWBC計數(shù)的相關(guān)性對上述3項指標采用Pearson直線相關(guān)分析，結(jié)果顯示CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細胞比例和hs-CRP、PWBC計數(shù)呈負相關(guān)（P＜0.01），見表4。hs-CRP和PWBC計數(shù)具有正相關(guān)性（r＝0.296，P＝0.03）。

表4 CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細胞比例與hs-CRP、PWBC計數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

ACS是由于冠狀動脈內(nèi)不穩(wěn)定的斑塊破潰和斑塊內(nèi)出血，繼發(fā)血栓形成，導致冠狀動脈管腔堵塞的一組臨床綜合征，其病程包括炎性反應和自身免疫反應［3］。Treg細胞是一組具有免疫負調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群，CD4＋CD25＋Treg細胞為其中數(shù)量少而作用重要的一群T淋巴細胞，具有免疫抑制性和免疫無能性，通過細胞間接觸和分泌具有抑制作用的細胞因子來發(fā)揮免疫負調(diào)節(jié)作用，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［4］。CD127是IL-7受體α鏈，在T淋巴細胞的增殖、分化和成熟中起重要作用，CD127在Treg細胞中低表達，聯(lián)合應用CD25高表達和CD127低表達，能夠有效去除CD25＋T淋巴細胞中效應T淋巴細胞，從而準確反映Treg細胞的數(shù)量［5］。

研究［6－7］顯示通過輸注或誘導產(chǎn)生Treg細胞可延緩AS的發(fā)展、抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，表明Treg細胞在AS及ACS的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。Sardella et al［8］研究發(fā)現(xiàn)ACS患者的CD4＋CD25＋Treg細胞數(shù)量減少，并且其抑制CD4＋CD25－效應T淋巴細胞增殖的能力減弱。本研究通過流式細胞儀檢測ACS組、SAP組及正常對照組外周血CD4＋CD25＋CD127lowTreg細胞表達水平，結(jié)果顯示ACS組外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細胞比例顯著低于SAP組和正常對照組，推測可能由于CD4＋CD25＋CD127lowTreg細胞的數(shù)量減少減弱了對機體炎癥反應的抑制作用，機體更易于發(fā)生炎癥免疫應答，從而導致炎癥激活、斑塊不穩(wěn)定及ACS的發(fā)生。因此，對CD4＋CD25＋CD127lowTreg細胞的檢測有可能作為衡量動脈粥樣硬化斑塊是否穩(wěn)定的指標之一。此外，SAP組的Treg細胞表達與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，可能由于SAP患者體內(nèi)多是穩(wěn)定性斑塊，并且局部炎癥反應較輕。

CD4＋效應性T細胞活化后高表達CD127 （CD127high），而真正的Treg細胞低表達CD127 （CD127low），因此CD127high可作為機體活化效應性T細胞的表面標志物［9］。王劍等［10］研究發(fā)現(xiàn)CD4＋CD25＋CD127lowTreg細胞具有抑制效應性T淋巴細胞增殖的能力，而且隨著CD4＋CD25＋CD127lowTreg細胞的減少，CD4＋CD25＋CD127highT淋巴細胞的增殖指數(shù)逐步升高?；赥reg細胞與效應性T淋巴細胞的相互抑制作用，控制Treg細胞／CD4＋CD25＋CD127high的比值、提高效應性T淋巴細胞對Treg細胞的抑制作用可能為ACS患者提供一種新的免疫治療方案［11］。

CRP是人體非特異性炎癥反應最敏感的標志物之一，目前hs-CRP在AS發(fā)生發(fā)展過程中的作用日益明顯，hs-CRP可以作為炎性指標中預測冠心病事件的獨立因子［12］。本研究結(jié)果顯示，正常對照組、SAP組及ACS組hs-CRP水平呈上升趨勢，其中在ACS組升高顯著，表明體內(nèi)可能存在內(nèi)環(huán)境紊亂、炎性反應增加、免疫活動過強等情況。

Hillis et al［13］研究發(fā)現(xiàn)PWBC計數(shù)水平在冠心病患者中明顯升高，而且病變嚴重時和急性期更加明顯，同時發(fā)生PWBC計數(shù)水平與ACS患者住院不良事件的發(fā)生呈顯著正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ACS組的PWBC水平較SAP組和正常對照組顯著升高，SAP組PWBC水平較正常對照組也明顯升高。同時CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細胞比例與hs-CRP、PWBC計數(shù)的相關(guān)性分析顯示其存在負性相關(guān)，表明冠心病患者體內(nèi)炎性反應高度激活，免疫活動過強與體內(nèi)CD4＋CD25＋CD127lowTreg細胞降低存在一定聯(lián)系，但其具體機制尚不明確，需要進一步研究。

綜上所述，CD4＋CD25＋CD127lowTreg細胞在AS 和ACS的發(fā)生、發(fā)展中扮演了很重要的角色，但由于本研究的樣本量較小，實驗結(jié)果存在一定的局限性。今后通過更大樣本、更完善的臨床試驗深入研究Treg細胞在AS及ACS中的免疫調(diào)節(jié)機制，有助于尋找免疫治療新策略。

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The change and clinical significance of circulating CD4＋CD25＋CD127lowregulatory T cells in patients with acute coronary syndrome

Xu Linjie，Wu Jixiong，Xu Banglong，et al
（Dept of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo investigate the change of CD4＋CD25＋CD127lowregulatory T（Treg）cells in peripheral blood of patients with acute coronary syndrome（ACS）and explore its clinical significance.Methods96 subjects were divided into three groups：ACS（n＝48），stable angina pectoris（SAP，n＝24）and normal patients（n＝24）.CD4＋CD25＋CD127lowTreg cells were detected by flow cytometry，and the levels of high-sensitivitiy C-reactive protein（hs-CRP），peripheral white blood cells（PWBC）were tested in each group.ResultsThe ratio of CD4＋CD25＋CD127lowTreg cells in peripheral blood of patients with ACS［（3.18±1.76）%］was significantly lower than that of normal patients［（5.64±1.63）%］and patients with SAP［（5.60±1.56）%］（F＝25.247，P＜0.01）.The levels of hs-CRP，PWBC in patients with ACS were higher than that of normal patients and patients with SAP（P＜0.05）.Besides，the level of CD4＋CD25＋CD127lowTreg cells was negatively correlated with hs-CRP and PWBC（r＝－0.518，－0.311 respectively；P＜0.01）.ConclusionIn ACS patients，the decreased Treg cells may participate in the development of atherosclerosis through break the balance of peripheral immune-tolerance and activate the inflammatory response.

acute coronary syndrome；regulatory T cells；high-sensitivitiy C-reactive protein；white blood cell；flow cytometry

R 541.4；R 392.12；R 341

1000－1492（2014）05－0637－04

2013－11－25接收

安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 230601

徐林杰，女，碩士研究生；

吳繼雄，男，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：WJX8261＠163.com