腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子緩釋膠原凝膠支架對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞生長和分化的影響

黃 斐，馬廣文，尹宗生，王 清，尹 勇

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子緩釋膠原凝膠支架對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞生長和分化的影響

黃 斐1，馬廣文1，尹宗生2，王 清1，尹 勇1

目的觀察腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）緩釋膠原凝膠支架對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞生長和分化的影響。方法將BDNF與膠原凝膠溶液混合，制備成BDNF緩釋支架，采用ELISA法檢測(cè)緩釋支架中BDNF的釋放曲線，然后將大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞接種于緩釋支架中作為實(shí)驗(yàn)組，并觀察神經(jīng)干細(xì)胞在緩釋支架中的生長情況。以常規(guī)添加BDNF并懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞作為對(duì)照組，采用免疫熒光方法鑒定緩釋支架中神經(jīng)干細(xì)胞分化成不同神經(jīng)細(xì)胞的比例，并用細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（CCK-8）檢測(cè)不同培養(yǎng)組中神經(jīng)干細(xì)胞的活力。結(jié)果ELISA結(jié)果顯示緩釋支架可以持續(xù)釋放BDNF達(dá)到10 d，體外實(shí)驗(yàn)顯示該緩釋支架與神經(jīng)干細(xì)胞有較好的生物相容性，CCK-8檢測(cè)顯示緩釋支架中神經(jīng)干細(xì)胞活力優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05），免疫熒光證實(shí)緩釋支架中神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的比例要高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論BDNF緩釋膠原凝膠支架具有良好的生物相容性，可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生存并誘導(dǎo)其分化成神經(jīng)元。

神經(jīng)干細(xì)胞；膠原凝膠；神經(jīng)球；胚胎；大鼠

神經(jīng)干細(xì)胞具有增殖、自我更新和多向分化能力［1］，是目前常用的種子細(xì)胞。研究［2－3］表明移植外源性神經(jīng)干細(xì)胞治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可以促進(jìn)其功能恢復(fù)，但是為了達(dá)到治療效果，就需要在體外培養(yǎng)足夠數(shù)量的細(xì)胞，并誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞主要向神經(jīng)元分化。研究［4－6］顯示神經(jīng)干細(xì)胞的生存、增殖和分化都受到神經(jīng)營養(yǎng)因子的調(diào)控。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是目前研究較多的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，它可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生存，并誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向γ-氨基丁酸（Gamma-amino butyric acid，GABA）能神經(jīng)元分化［7］，因此在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)常加入BDNF進(jìn)行誘導(dǎo)分化。然而有研究［8］顯示神經(jīng)營養(yǎng)因子加入到培養(yǎng)液后很快就失活，只有少部分的神經(jīng)營養(yǎng)因子能與細(xì)胞相互作用，為了解決這個(gè)問題，該研究利用膠原凝膠與BDNF相互混合構(gòu)建BDNF緩釋膠原凝膠支架，并觀察緩釋支架對(duì)BDNF生物活性的保護(hù)作用，以及對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞生長和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物孕14 d的SD大鼠3只，雌性，清潔級(jí)，300～320 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器DMEM／F12培養(yǎng)基、B27和胎牛血清（美國Gibco公司）；表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）（美國Pepro-Tech公司）；Ⅰ型鼠尾膠原、accutase酶和DAPI（美國Sigma公司）；一抗兔抗大鼠Nestin多克隆抗體（英國Abcam公司）；小鼠抗大鼠βⅢ-tubulin單克隆抗體、兔抗大鼠GFAP多克隆抗體和小鼠抗大鼠CNPase單克隆抗體（美國Chemicon公司）；熒光二抗（美國Jackson公司）；細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（CCK-8，日本Dojindo公司）；BX-51免疫熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)將SD大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，用75%乙醇溶液浸泡5 min，無菌條件下取出胎鼠大腦皮質(zhì)放入預(yù)冷的DMEM／F12培養(yǎng)液中，用眼科剪將組織塊剪成1 mm×1 mm ×1 mm大小，用吸管反復(fù)吹打后取上清液，通過200目濾網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，收集單細(xì)胞懸液800 r／min離心10 min，棄上清，加入含有2%B27、20 ng／ml EGF和b-FGF的DMEM／F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2×105／ml接種到50 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)培養(yǎng)5～7 d后將神經(jīng)干細(xì)胞收集到離心管中，800 r／min離心5 min后，棄上清液加入0.5 ml accutase酶，37℃孵育10 min后，加入等量培養(yǎng)液終止消化，用經(jīng)火焰拋光的吸管吹打制成單細(xì)胞懸液，800 r／min離心5 min后，棄上清液定量加入培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為2× 105／ml接種到50 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以后每2～3 d進(jìn)行半量換液，每6～7 d傳代1次

1.5 構(gòu)建BDNF凝膠緩釋支架無菌條件下用三蒸水將BDNF溶解成100 μg／ml，將Ⅰ型膠原蛋白用三蒸水溶解成0.5 mg／ml，取40 ng BDNF與200 μl膠原凝膠混合后，平鋪于細(xì)胞爬片上，然后在無菌條件下4℃風(fēng)干保存。

1.6 BDNF緩釋凝膠支架體外釋放檢測(cè)BDNF

體外釋放實(shí)驗(yàn)可采取雙抗夾心ELISA法測(cè)定。神經(jīng)干細(xì)胞接種于緩釋支架中作為實(shí)驗(yàn)組，在神經(jīng)干細(xì)胞與緩釋支架混合培養(yǎng)后6、12 h，1、3、5、7、10 d分別取細(xì)胞培養(yǎng)液100 μl，按ELISA試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)，用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)出液體中BDNF吸光度，以吸光度間接反應(yīng)BDNF濃度，繪制出BDNF釋放曲線。以常規(guī)添加相同數(shù)量的BDNF并懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞作為對(duì)照組，并在相同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)BDNF濃度。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.7 細(xì)胞活力檢測(cè)采用CCK-8檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞與緩釋支架共培養(yǎng)時(shí)的活力。采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板檢測(cè)，具體操作方法按照CCK-8說明書進(jìn)行，神經(jīng)干細(xì)胞密度為5×104／ml，每組共有5個(gè)培養(yǎng)孔，每孔加入100 μl，在培養(yǎng)1、4、7 d后，每孔加入10 μl CCK-8在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm，參考波長為650 nm的吸光度值（A）。

1.8 緩釋凝膠支架對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化潛能的影響的測(cè)定神經(jīng)干細(xì)胞與緩釋凝膠支架共培養(yǎng)1周后，免疫熒光方法檢測(cè)共培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞分化潛能。細(xì)胞用預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定20 min，再用含有5%正常山羊血清和0.3%Triton X-100的PBS濕盒內(nèi)室溫封閉通透1 h后，加入一抗神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin（1∶250）、神經(jīng)元標(biāo)志物βⅢ-tubulin（1∶100）、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP （1∶400）、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CNPase（1∶200），4℃孵育過夜后，加入相應(yīng)熒光二抗室溫孵育1 h，加入DAPI復(fù)染細(xì)胞核，各步驟之間PBS洗3次，在免疫熒光顯微鏡下觀察。測(cè)定神經(jīng)干細(xì)胞分化潛能時(shí)，隨機(jī)選取20個(gè)視野，以DAPI染色的細(xì)胞核數(shù)為總細(xì)胞數(shù)，分別計(jì)數(shù)βⅢ-tubulin、GFAP和CNPase陽性細(xì)胞數(shù)來計(jì)算神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化比例。對(duì)照組每天在培養(yǎng)液中加入40 ng BDNF培養(yǎng)1周后，去除EGF和b-FGF誘導(dǎo)神經(jīng)球貼壁，同樣用免疫熒光方法鑒定其分化潛能。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)和鑒定分離的細(xì)胞在無血清并含有EGF、b-FGF的培養(yǎng)液中懸浮生長形成神經(jīng)球，懸浮生長4～5 d的神經(jīng)球傳代后，可以形成新的神經(jīng)球。收集神經(jīng)球制成單細(xì)胞懸液，在1%胎牛血清的誘導(dǎo)下，神經(jīng)球來源的細(xì)胞貼壁分化形成神經(jīng)細(xì)胞。免疫熒光顯示神經(jīng)球表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin。因此懸浮神經(jīng)球可以認(rèn)為是神經(jīng)干細(xì)胞，見圖1。

圖1 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

2.2 緩釋支架材料上BDNF的釋放曲線BDNF在最初的24 h內(nèi)累計(jì)釋放量為61.1%，表現(xiàn)為釋放曲線的急劇上升，顯示BDNF為爆發(fā)性釋放，而2 d后釋放曲線緩慢上抬，7 d時(shí)累計(jì)釋放量達(dá)到89.9%，表現(xiàn)為BDNF的持續(xù)緩慢釋放。在任何時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組BDNF都未能檢測(cè)出，兩組之間在不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間段的釋放率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 BDNF的釋放曲線

2.3 神經(jīng)干細(xì)胞與緩釋支架共培養(yǎng)將神經(jīng)干細(xì)胞按1×105／ml種入0.5 mg／ml的膠原凝膠緩釋支架中進(jìn)行共培養(yǎng)，由于這些細(xì)胞來源單一，光鏡下觀察細(xì)胞折光性強(qiáng)，細(xì)胞活力較好，培養(yǎng)7 d后緩釋支架中的細(xì)胞增殖形成神經(jīng)球，見圖3。

圖3 神經(jīng)干細(xì)胞在與緩釋支架共培養(yǎng)

2.4 細(xì)胞活力檢測(cè)用CCK-8來檢測(cè)細(xì)胞活力，培養(yǎng)1 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。培養(yǎng)4 d時(shí)，隨著BDNF的持續(xù)釋放，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力要高于對(duì)照組（P＜0.05），而培養(yǎng)7 d時(shí)隨著緩釋支架中BDNF釋放的減少，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 CCK-8檢測(cè)不同培養(yǎng)組中神經(jīng)干細(xì)胞的活力

2.5 緩釋支架對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響將膠原凝膠三維培養(yǎng)1周后的神經(jīng)干細(xì)胞用1%胎牛血清誘導(dǎo)分化5 d后，免疫熒光顯示實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)干細(xì)胞分化為βⅢ-tubulin陽性率為（38.26±1.56）%、GFAP陽性率為（48.62±4.78）%、CNPase陽性率為（15.47±1.32）%，而對(duì)照組中的神經(jīng)干細(xì)胞分化為βⅢ-tubulin陽性率為（18.29±1.86）%、GFAP陽性率為（71.27±4.22）%、CNPase陽性率為（11.32±1.43）%，見圖5。兩組間分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 免疫雙標(biāo)顯示不同培養(yǎng)組中神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞 ×400

3 討論

目前對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷缺乏有效的治療手段，神經(jīng)干細(xì)胞因?yàn)榫哂蟹只缮窠?jīng)細(xì)胞的潛能而受到廣泛研究。神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)干細(xì)胞的生存、增殖和分化中都起到了重要的調(diào)控作用。BDNF目前研究較為廣泛，該研究表明BDNF可以通過酪氨酸激酶B（TrKB）受體促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。然而BDNF在培養(yǎng)液中半衰期很短，只有少量的BDNF與細(xì)胞發(fā)生作用，因此在本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建BDNF-膠原凝膠緩釋支架載體，來維持BDNF的活性，促進(jìn)BDNF與神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生作用，維持神經(jīng)干細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)分化。

膠原凝膠是水凝膠的一種，擁有水凝膠的特點(diǎn)，可以形成立體三維網(wǎng)狀支架，同時(shí)膠原蛋白作為天然的細(xì)胞外基質(zhì)，具有無毒性、低免疫原性和可降解性等優(yōu)點(diǎn)［9-11］。有研究［12］表明神經(jīng)干細(xì)胞可以在膠原凝膠支架中增殖并傳代，同時(shí)膠原凝膠支架可以維持神經(jīng)干細(xì)胞的干細(xì)胞特性，而對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的分化無明顯影響。一些學(xué)者也將膠原凝膠支架作為緩釋載體進(jìn)行研究，Bhang et al［13］研究發(fā)現(xiàn)利用膠原凝膠支架和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3構(gòu)建的緩釋系統(tǒng)可以極大的減少PC-12細(xì)胞培養(yǎng)所需的生長因子數(shù)量，而且膠原凝膠支架可以維持神經(jīng)營養(yǎng)因子-3的活性，延長它的作用時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)顯示膠原凝膠中BDNF的釋放符合雙相動(dòng)力學(xué)釋藥規(guī)律，既有初期的快速釋放，也有后期的緩釋，這種釋放特點(diǎn)可以在局部形成有效濃度，有助于神經(jīng)干細(xì)胞的生長和分化。CCK-8檢測(cè)顯示BDNF-膠原凝膠實(shí)驗(yàn)組中的神經(jīng)干細(xì)胞活力要高于在對(duì)照組中神經(jīng)干細(xì)胞活力，同時(shí)免疫熒光結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的比例也高于對(duì)照組。

本研究表明BDNF復(fù)合于膠原凝膠中，可以達(dá)到緩釋的目的，構(gòu)建了帶有生長因子緩釋效果的生物支架，該支架能夠很好的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的生長并提高神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的比例，為后期進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

［1］Chojnacki A，Weiss S.Production of neurons，astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells［J］.Nat Protoc，2008，3（6）：935－40.

［2］Sandner B，Prang P，Rivera F J，et al.Neural stem cells for spinal cord repair［J］.Cell Tissue Res，2012，349（1）：349－62.

［3］Goldman S.Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system［J］.Nat Biotechnol，2005，23（7）：862－71.

［4］Choi K C，Yoo D S，Cho K S，et al.Effect of single growth factor and growth factor combinations on differentiation of neural stem cells［J］.J Korean Neurosurg Soc，2008，44（6）：375－81.

［5］Oh J，McCloskey M A，Blong C C，et al.Astrocyte-derived interleukin-6 promotes specific neuronal differentiation of neural progenitor cells from adult hippocampus［J］.J Neurosci Res，2010，88（13）：2798－809.

［6］Johansson S，Price J，Modo M.Effect of inflammatory cytokines on major histocompatibility complex expression and differentiation of human neural stem／progenitor cells［J］.Stem Cells，2008，26 （9）：244－54.

［7］Elliott R C，Black I B，Dregfus C F.Differential regulation of p75 and trkB mRNA expression after depolarizing stimuli or BDNF treatment in basal forebrain neuron cultures［J］.J Neurosci Res，2001，66（1）：83－8.

［8］Schuss Z，Singer A，Holcman D.The narrow escape problem for diffusion in cellular microdomains［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（44）：16098－103.

［9］Watanabe K，Nakamura M，Okano H，et al.Establishment of three-dimensional culture of neural stem／progenitor cells in collagen type-1 Gel［J］.Restor Neurol Neurosci，2007，25（2）：109 －17.

［10］Ma W，F(xiàn)itzgerald W，Liu Q Y，et al.CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels［J］.Exp Neurol，2004，190（2）：276－88.

［11］Yang Z，Mo L，Duan H，et al.Effects of chitosan／collagen substrates on the behavior of rat neural stem cells［J］.Sci China Life Sci，2010，53（2）：215－22.

［12］Huang F，Shen Q，Zhao J T.Growth and differentiation of neural stem cells in a three-dimensional collagen gel scaffold［J］.Neural Regener Res，2013，8（4）：313－9.

［13］Bhang S H，Lee T J，Lim J M，et al.The effect of the controlled release of nerve growth factor from collagen gel on the efficiency of neural cell culture［J］.Biomaterials，2009，30（1）：126－32.

Effects of slow-release of brain-derived neurotrophic factor from collagen gel on growth and differentiation of neural stem cells

Huang Fei1，Ma Guangwen1，Yin Zongsheng2，et al
（1Dept of Orthopaedics，The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Orthopaedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the effects of the slow-release of brain-derived neurotrophic factor（BDNF）from collagen gel on growth and differentiation of neural stem cells.MethodsBDNF was mixed with collagen gel to prepare BDNF-collagen gel slow-release scaffold.The quantity and duration of BDNF release from the scaffold were determined by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.The embryonic rat neural stem cells were seeded in BDNF-collagen gel slow-release scaffold，and to observe the survival of neural stem cells.With group of daily add-ition of BDNF as a control，the proportion of differentiated cells of neural stem cells in BDNF-collagen gel slow-release scaffold were identified by the immunofluorescence techniques.The cell viability of neural stem cells cultured in different groups was detected by Cell Counting Kit-8（CCK-8）assay.ResultsThe ELISA showed BDNF was released from collagen gel for at least 10 days in vitro.The study showed that the slow-release scaffold and neural stem cells had a good biocompatibility in vitro，and neural stem cells could survive in slow-release scaffold.The CCK-8 testing showed the neural stem cells in BDNF-collagen gel slow-release scaffold group had higher cell viabilities than those in the control group（P＜0.05）.Immunofluorescence showed the differentiation percentage from neural stem cells into neurons in the BDNF-collagen gel slow-release scaffold group was higher than those in the control group（P＜0.05）.ConclusionBDNF-collagen gel slow-release scaffold，with a good biocompatibility，can enhance survival of neural stem cells，and induce them to differentiate into neurons.

neural stem cells；collagen gel；neurosphere；embryo；rat

R 394.2

1000－1492（2014）05－0586－05

2013－12－20接收

安徽醫(yī)科大學(xué)校基金（編號(hào)：2013xkj045）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院骨科，合肥 230022

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，合肥 230022

黃 斐，男，醫(yī)師；

馬廣文，男，主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：hbmagw＠126.com