骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠肺氣腫模型治療機制的探討

王麗雁，吳 倩，王葉芳，汪偉民

骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠肺氣腫模型治療機制的探討

王麗雁，吳 倩，王葉芳，汪偉民

目的通過研究骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）對大鼠肺氣腫模型血清和肺泡灌洗液（BALF）中白介素-17（IL-17）、白介素-6（IL-6）的影響以及肺組織病理學變化，探討B(tài)MSC對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的干預機制。方法30只健康雄性SD大鼠，隨機分成3組：正常對照組、肺氣腫模型組、BMSC治療組。通過氣管內(nèi)注射豬胰蛋白酶誘導建立肺氣腫模型后，經(jīng)大鼠尾靜脈注射BMSC進行治療。兩周后處死大鼠，觀察肺組織病理學變化及血清和BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞百分比。使用ELISA方法檢測血清和BALF中IL-17、IL-6水平。結(jié)果與正常對照組相比，肺氣腫模型組和BMSC治療組BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞的百分比升高（P＜0.05），BMSC治療組較肺氣腫模型組顯著降低（P＜0.05）；ELISA法結(jié)果顯示肺氣腫模型組和BMSC治療組血清和BALF中IL-17、IL-6水平較正常對照組顯著升高，BMSC治療組明顯低于肺氣腫模型組（P＜0.05）；病理觀察肺氣腫模型組和BMSC治療組都可看到氣腫樣改變，BMSC治療組與肺氣腫模型組比較肺組織平均內(nèi)襯間隔（MLI）降低，單位面積平均肺泡數(shù)（MAN）增加（P＜0.05）。結(jié)論BMSC可能通過調(diào)節(jié)炎細胞的增殖及趨化來干預IL-17、IL-6表達，以及促進受損肺組織的修復，來發(fā)揮對COPD的干預作用。

慢性阻塞性肺疾??；骨髓間充質(zhì)干細胞；白介素-17；白介素-6

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）的發(fā)病與氣道慢性炎癥及自身免疫異常有關(guān)，患者體內(nèi)及氣道局部存在大量炎細胞和炎性介質(zhì)，如白介素（interleukin，IL）-17、IL-6。IL-17誘導多種趨化因子的分泌，引起氣道和肺組織的損傷。IL-6促進中性粒細胞氧化和誘導淋巴細胞分泌抗體，延遲炎細胞凋亡，加重氣道炎癥反應。研究［1］表明，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）可以通過全骨髓貼壁法獲得，且經(jīng)此方法獲得的細胞穩(wěn)定性和活力佳，分化潛能與安全性良好。該實驗通過將BMSC經(jīng)尾靜脈注入大鼠肺氣腫模型體內(nèi)，觀察BMSC對肺氣腫模型肺組織的修復以及對炎癥因子IL-17、IL-6的調(diào)節(jié)作用，初步探討B(tài)MSC對COPD的干預機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑SPF級健康雄性SD大鼠33只，含3只體重80～100 g的幼鼠，余大鼠體重180～220 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供；豬胰蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）購自美國羅氏公司；胰酶、胎牛血清、L-DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；大鼠IL-6、IL-17酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購自美國R＆D公司。

1.2 BMSC的采集、分離與培養(yǎng)選擇3只4周體重80～100 g的雄性SD大鼠，脫臼處死后，75%乙醇溶液浸泡10 min后，于超凈工作臺無菌分離雙側(cè)股骨，剪去包括骺板在內(nèi)的兩側(cè)骺端，用DMEM液反復沖洗骨髓腔，收集骨髓。將獲得的骨髓細胞懸浮液移入離心管，2 000 r／min離心10 min，棄上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（10%FBS，100 U／ml青霉素，100 U／ml鏈霉素）重懸，接種于25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h半量換液一次，去除未貼壁細胞，倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況及形態(tài)特征。以后每3 d換液一次。當細胞鋪滿瓶底約80%時，用0.25%胰蛋白酶37℃消化3 min，待細胞形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形后，停止消化，按1∶2傳代培養(yǎng)。

1.3 大鼠肺氣腫模型的制備、實驗分組及處理30只雄性健康SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為3組：正常對照組、肺氣腫模型組、BMSC治療組，每組各10只。將肺氣腫模型組和BMSC治療組大鼠分別稱體重后，用體積分數(shù)為10%的水合氯醛（300 mg／kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后，將大鼠固定于操作臺上，常規(guī)消毒，縱向切開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織及胸骨舌骨肌，暴露氣管，4號針頭刺入氣管內(nèi)一次性滴入配制的PPE生理鹽水溶液1 U／g，并注入少量空氣保證試劑或生理鹽水全部進入氣管，縫合皮膚，切口消毒，然后直立旋轉(zhuǎn)大鼠，并按摩雙側(cè)胸部，使試劑均勻分布于雙側(cè)肺。正常對照組依同樣方法注入等體重比量的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）。將鼠放入獨立盒中，注意保溫，等清醒后放入原盒中，以普通飼料喂養(yǎng)12周后。待大鼠肺氣腫模型成功后，BMSC治療組大鼠經(jīng)尾靜脈注入濃度為1×106個／ml的第3代BMSC 1 ml，正常對照組及肺氣腫模型組給予等量PBS處理，各組繼續(xù)飼養(yǎng)2周后處死所有大鼠。

1.4 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）細胞計數(shù)及IL-17、IL-6水平檢測大鼠稱重、腹腔麻醉后固定，無菌條件腹主動脈取血，標本室溫下靜止2 h后，3 000 r／min離心5 min，收集血清，分裝儲存于－80℃?zhèn)溆谩１┞稓夤芎头伍T，于右主支管處結(jié)扎右肺，生理鹽水2 ml×3次行左肺肺泡灌洗，回收的BALF存入硅塑管內(nèi)，以1 500 r／min離心10 min，取上清液凍存－80℃?zhèn)溆?。同時收集細胞并計算中性粒細胞和淋巴細胞百分率。按ELISA試劑盒說明書檢測血清和BALF中IL-17、IL-6的濃度。

1.5 肺組織標本的留取肺泡灌洗完畢后棄左肺，切取右側(cè)肺組織，置于4℃PBS中洗去血液。所有大鼠取右肺組織浸入10%福爾馬林液中固定24 h，制備蠟塊。

1.6 肺組織病理學觀察各組大鼠肺組織切片行HE染色作常規(guī)病理學檢查。每例標本選2張切片，每切片隨機取上、下、左、右、中5個視野，測量時盡量避開支氣管及大、中血管。觀察肺平均內(nèi)襯間隔（mean linear intercept，MLI）和單位面積平均肺泡數(shù)（mean alveolar numbers，MAN）。每只大鼠檢測10個區(qū)域。

1.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析及SNK檢驗。

2 結(jié)果

2.1 BMSC的培養(yǎng)原代培養(yǎng)24 h后，可見少量貼壁細胞，細胞大小及形態(tài)不均一，呈圓形或內(nèi)皮細胞樣；培養(yǎng)48 h半量換液，去除未貼壁的細胞，此時細胞開始融合，在集落中心密集，且集落間出現(xiàn)重疊，見圖1A；約7 d細胞融合達80%以上，傳代后細胞呈均勻分布的長梭形生長，平行或螺旋狀排列，見圖1B。本實驗通過全骨髓貼壁法獲得BMSC。

圖1 體外培養(yǎng)BMSC的形態(tài)學觀察 ×200

2.2 血清和BALF細胞計數(shù)肺氣腫模型組、BMSC治療組血清和BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞百分比顯著高于正常對照組（P＜0.01）。BMSC治療組大鼠BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞百分比均低于肺氣肺模型組（P＜0.05），見表1。

2.3 血清及BALF中IL-17、IL-6水平ELISA結(jié)果顯示：肺氣腫模型組與正常對照組比較，BALF和血清中IL-17、IL-6水平均明顯升高（P＜0.01）；且BMSC治療組與肺氣腫模型組比較，BALF中IL-17、IL-6水平均下降（P＜0.05），見表2。

表1 3組大鼠BALF中細胞計數(shù)及分類（n＝10，±s）

表1 3組大鼠BALF中細胞計數(shù)及分類（n＝10，±s）

與正常對照組比較：**P＜0.01；與肺氣腫模型組比較：ΔP＜0.05

組別白細胞總數(shù)（×109／L）中性粒細胞百分比（%）淋巴細胞百分比（%）正常對照2.41±0.687.96±3.76.42±1.45肺氣腫模型5.33±0.57**24.01±4.91**12.50±2.39**BMSC治療3.73±0.77Δ15.32±2.27Δ8.23±1.54Δ

表2 3組大鼠BALF和血清中的IL-17和IL-6水平（ng／L，n＝10，±s）

表2 3組大鼠BALF和血清中的IL-17和IL-6水平（ng／L，n＝10，±s）

與正常對照組比較：**P＜0.01；與肺氣腫模型組比較：ΔP＜0.05

組別血清BALF IL-17IL-6 IL-17IL-6正常對照41.31±3.1211.64±0.8954.61±4.1215.89±1.52肺氣腫模型60.50±5.24**23.22±1.42**72.42±4.48**32.12±2.23**BMSC治療50.60±3.62Δ17.24±3.04Δ60.83±3.76Δ24.14±3.42Δ

2.4 大鼠肺組織病理學結(jié)果正常對照組大鼠肺組織肉眼觀表面光滑淡紅色，質(zhì)地較軟，且富有彈性，指壓無痕，鏡下見肺組織均勻一致。肺氣腫模型組大鼠肺臟肉眼見肺組織體積增大表面有囊泡狀突起，色澤蒼白，質(zhì)地較硬且彈性差，指壓后見壓痕，切面可見肺組織形態(tài)大小不均一。HE染色結(jié)果顯示：除正常對照組以外，肺氣腫模型組和BMSC治療組的肺組織均出現(xiàn)肺泡壁不同程度的變薄，部分斷裂，肺泡腔擴大。BMSC治療組較肺氣腫模型組肺氣腫明顯減輕，見圖2。單位面積內(nèi)，肺氣腫模型組和BMSC治療組的MAN小于正常對照組，而MLI大于正常對照組（P＜0.05）；BMSC治療組與肺氣腫模型組相比，MAN大于肺氣腫模型組，MLI小于肺氣腫模型組（P＜0.05），見表3。

圖2 大鼠肺組織病理學結(jié)果×200

表3 3組大鼠肺組織病理學比較（n＝10，±s）

表3 3組大鼠肺組織病理學比較（n＝10，±s）

與正常對照組比較：*P＜0.05；與肺氣腫模型組比較：ΔP＜0.05

組別MLI（μm）MAN（個／102mm）正常對照40.38±3.144.73±1.01肺氣腫模型50.88±2.34*2.28±0.89*BMSC治療45.63±1.60Δ3.90±0.62Δ

3 討論

COPD的發(fā)病與機體肺組織接觸有害氣體和微小顆粒引起的異常炎癥反應有關(guān)。吸煙是COPD主要的危險因素，但也只有20%～30%的吸煙者最終發(fā)展為COPD［2］，這些人共同的特點是具有嚴重的氣道炎性反應，最重要的是在停止吸煙的情況下，這種炎癥反應不會因此停止。Agusti et al［3］首先提出COPD存在自身免疫應答假說。目前認為，COPD是由T淋巴細胞參與的慢性炎癥反應和自身免疫反應所引起的疾病。

IL-17是由T淋巴細胞及多種細胞分泌的一類炎性介質(zhì)。研究［4－5］表明，COPD患者呼吸道IL-17A／F的表達是上調(diào)的，且IL-17A基因缺失將會降低香煙煙霧引起的炎癥和肺泡Ⅱ型細胞凋亡。IL-17誘導呼吸道上皮細胞分泌中性粒細胞趨化因子IL-8，增強ICAM-1表達促進炎細胞的活化及黏附，使支氣管上皮細胞變性、壞死、脫落，黏液分泌亢進，纖毛運動減退，炎癥反復發(fā)作遷延不愈。另外，IL-17誘導中性粒細和肺泡巨噬細胞釋放彈性蛋白酶，造成肺泡壁的斷裂，肺大泡形成。本實驗中肺氣腫模型組血清與BALF中IL-17濃度較正常對照組明顯增高，BMSC干預后IL-17水平的降低，表明IL-17與COPD形成過程有著密切聯(lián)系。

IL-6是由淋巴細胞、單核／巨噬細胞等多種細胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)。IL-6水平升高是COPD急性加重期的一個重要特征［6－7］，與小氣道的炎癥嚴重程度有關(guān)，且IL-6降低肺功能［8］。IL-6促進B細胞的分化及分泌抗體，使中性粒細胞氧化延緩凋亡，增加炎細胞的黏附作用及細胞外蛋白酶的活性。本研究結(jié)果顯示，肺氣腫模型組血清及BALF中IL-6的顯著增高，與以往的研究相同，表明IL-6與COPD發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性。

研究［1］表明通過全骨髓貼壁法可以獲得BMSC。Weiss et al［9］對接受BMSC治療的COPD患者進行為期2年的隨訪，結(jié)果顯示BMSC對COPD的治療具有安全性。BMSC分化為氣道上皮細胞和肺泡Ⅱ型細胞修復受損的肺組織，分泌各類生長因子誘導細胞增生，增加肺小動脈的數(shù)量，緩解肺動脈高壓和減輕肺血管的重塑［10］；BMSC作為免疫調(diào)節(jié)細胞，減輕肺局部異常免疫反應，從而為損傷肺組織的修復提供有利環(huán)境。體外實驗［11－12］表明，BMSC和T淋巴細胞共培養(yǎng)，可抑制淋巴細胞、NK細胞的增殖，降低其分泌的炎性介質(zhì)水平，從而減輕局部的炎癥反應。

研究［13］表明，用熏煙和注射胰蛋白酶兩種方法誘導的肺氣腫模型病理學特點和血液中的IL-17無明顯差異。本研究通過氣管內(nèi)注入PPE誘導COPD模型，病理學觀察肺氣腫模型組和BMSC治療組肺組織均出現(xiàn)肺泡壁變薄，部分斷裂，肺泡腔擴大。肺氣腫模型組BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞百分比均有不同程度增高，表明中性粒細胞和淋巴細胞在COPD患者氣道及肺泡局部聚集。肺氣腫模型組血液和BALF中的IL-17、IL-6較正常組對照組明顯升高，經(jīng)BMSC干預后降低，表明BMSC可能是通過抑制淋巴細胞和中性粒細胞等炎癥細胞產(chǎn)生IL-17、IL-6，從而抑制COPD的慢性炎癥反應。本研究顯示，BMSC干預后MAN較肺氣腫模型組增大，MLI減小，表明BMSC對肺小葉有修復作用。但這種對肺小葉的修復機制是通過抑制局部炎性反應，還是通過BMSC的定向分化為肺泡上皮產(chǎn)生，亦或兩者的協(xié)同作用，尚需進一步研究證實。而BMSC對COPD的進展發(fā)揮了明顯的干預作用卻是顯而易見的。

綜上所述，由于肺組織的特殊結(jié)構(gòu)促使BMSC能夠高比例的定植于受損的肺組織，BMSC對COPD的治療作用可能是通過抑制炎性細胞的增殖分化，調(diào)節(jié)炎細胞和炎癥介質(zhì)水平來減少肺組織的損害。這將為臨床探索治療COPD的新方法提供重要參考。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on cytokines of IL-17，IL-6 in rat model of emphysema

Wang Liyan，Wu Qian，Wang Yefang，et al
（Dept of Geriatric Pulmonary Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo explore the mechanism of MSC treatment for COPD by studying the effect of bone marrow mesenchymal stem cells on IL-6 and IL-17 in BALF and serum of emphysema model，as well as lung pathological changes.MethodsThirty healthy male SD rats were randomly divided into 3 groups，normal control group，emphysema model group，BMSC treatment group.After establishing rat models of COPD through endotracheal injection which induced in porcine trypsin，biological treatment was given by injecting BMSC via rat caudal vein.All rats were executed two weeks later，observing the pathological changes of lung tissues and the total number of white blood cells，the percentage of neutrophils and lymphocytes in BALF and serum.Using the ELISA method to detect the level of IL-17 and IL-6 in serum and BALF.ResultsCompared with normal control group，the WBC total number，percentage of neutrophil and lymphocyte increased in BALF of emphysema model group and BMSC treatment group（P＜0.05），and BMSC treatment group was significantly lower than that in emphysema model group（P ＜0.05）；ELISA results showed that the level of IL-17，IL-6 in serum and BALF of emphysema model group and BMSC treatment group was significantly higher than normal control group，BMSC treatment group was lower than that in emphysema model group（P＜0.05）.Emphysema-like changes could be seen in emphysema model group and BMSC treatment，compared with emphysema model group the average lung tissue lining interval（MLI）in BMSC treatment group was decreased，while the mean alveolar number（MAN）per unit area was increased，and thedifference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionBone marrow mesenchymal stem cells may have intervention effect on COPD，by regulating inflammation cell proliferation and chemotaxis to intervene the expression of IL-17 and IL-6，as well as promote the the damaged lung tissue to repair.

chronic obstructive pulmonary disease；bone marrow derived mesenchymal stem cell；IL-17；IL-6

R 563.3；R 392.4；R 392.114

1000－1492（2014）05－0572－05

2014－03－25接收

安徽省教育廳自然科學基金（編號：KJ2009A118）

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年呼吸內(nèi)科，合肥 230022

王麗雁，女，碩士研究生；

汪偉民，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：wangwm7＠tom.com