利用HPLC法測定不同馬鈴薯品種莖葉中的α-茄堿含量

羅愛花，徐美蓉，陸立銀，胡新元，文國宏，謝奎忠

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院質(zhì)量標準研究所，甘肅蘭州730070)

利用HPLC法測定不同馬鈴薯品種莖葉中的α-茄堿含量

羅愛花1*，徐美蓉2，陸立銀1，胡新元1，文國宏1，謝奎忠1

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院質(zhì)量標準研究所，甘肅蘭州730070)

馬鈴薯莖葉具有較高的飼用價值，但馬鈴薯莖葉中α-茄堿（龍葵素）含量高，適口性差，不易青貯，是影響馬鈴薯莖葉利用的主要因素。研究馬鈴薯莖葉中龍葵素的含量變化可為其利用提供安全技術(shù)保障。將馬鈴薯莖葉收獲后風干粉碎，用乙醇-乙酸法提取，高效液相色譜法(HPLC法)測定混合樣品中的α-茄堿含量，研究不同馬鈴薯品種莖葉中α-茄堿含量的差異。結(jié)果表明：‘費烏瑞它’、‘克新2號’、‘隴薯3號’、‘隴薯6號’、‘隴薯7號’5個馬鈴薯品種莖葉樣品中α-茄堿的含量分別為0.138，0.171，0.159，0.185和0.199 mg/g。莖葉中α-茄堿的含量存在基因型差異。

馬鈴薯；品種；莖葉；α-茄堿

α-茄堿（Solanine）稱龍葵素，也叫馬鈴薯素，是從馬鈴薯、西紅柿、茄子等茄科植物中發(fā)現(xiàn)的有毒的糖苷生物堿，具有抗腫瘤、抑菌、強心、鎮(zhèn)痛等多種功效[1-3]。目前對馬鈴薯塊莖中α-茄堿含量的提取以及測定已有很多不同的報道[4-6]，而對馬鈴薯莖葉、葉片中α-茄堿含量的研究報道相對較少。馬鈴薯莖葉柔嫩多汁，青貯馬鈴薯葉的營養(yǎng)成分明顯高于許多青貯植物的莖葉，有較高的飼用價值[7,8]。但是馬鈴薯莖葉α-茄堿含量高，適口性差，含糖少，不易青貯，水分含量高，難以保存。α-茄堿是影響馬鈴薯莖葉利用的主要因素，通過研究馬鈴薯莖葉中α-茄堿的含量變化可為其利用提供安全技術(shù)保障。馬鈴薯植株中糖苷生物堿的含量根據(jù)品種及起源、生育時期、器官、栽培和貯藏條件等不同而有比較大的差異[9]。了解馬鈴薯整個植株中α-茄堿含量的高低，對馬鈴薯莖葉利用乃至生物堿開發(fā)有著極其重要的意義。

本試驗通過系統(tǒng)優(yōu)化篩選HPLC分析條件，建立了快速、準確分析馬鈴薯中α-茄堿的HPLC方法，為馬鈴薯中α-茄堿提取物的工業(yè)化生產(chǎn)和開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 材料

以馬鈴薯品種‘費烏瑞它’、‘克新2號’、‘隴薯3號’、‘隴薯6號’、‘隴薯7號’的莖葉風干粉碎混合樣為試驗材料。

1.1.2 儀器

Waters 2595高效液相色譜儀（美國Waters），2487紫外檢測器（美國Waters）。

1.1.3 試劑

α-茄堿（標樣，Sigma公司，純度≥99%），乙醇（AR 95%），冰醋酸（AR），甲醛（AR），乙腈（CP），氨水（AR），硫酸（AR），甲醇（CP），磷酸（AR）。

1.2 色譜條件

色譜柱：C18不銹鋼柱（ODS 5 μm,4.6 mm× 25 cm）；流動相：乙腈/磷酸二氫鉀(30∶70，V/V);流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

將馬鈴薯莖稈和葉片經(jīng)風干、粉碎混勻待用。稱取粉碎后馬鈴薯莖葉混合樣12 g，加無水乙醇/乙酸混合提取液（100∶30，V/V）攪拌10 min，70℃回流10 h后過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，用5%硫酸20 mL溶解膏狀物，超聲處理45 min后過濾，濾液用濃氨水調(diào)至pH=10，低溫離心（5 000 r/min） 15 min，棄去上清液，沉淀用l%氨水洗滌，至洗滌液澄清，將結(jié)晶狀沉淀用甲醇溶解并定容至10 mL，過0.45 μm膜過濾備用。

1.3.2 α-茄堿含量測定

α-茄堿標準曲線測定：準確稱取α-茄堿標準品30 mg，以甲醇溶解，分別配制成0.15、0.30、0.60、1.20、1.80、2.40和3.00 mg/mL的標準液，在上述色譜條件下進樣10 μL，以α-茄堿的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

馬鈴薯莖葉中α-茄堿含量定性分析：在最優(yōu)色譜條件下對馬鈴薯莖葉中α-茄堿成分進行分離。采用保留時間對照法和內(nèi)標法確定α-茄堿的出峰時間。準確稱取馬鈴薯莖葉混合樣品12 g，分別加入一定量的α-茄堿標準品，以峰面積外標法定量測定混合樣中α-茄堿的含量，5次重復，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD）。

馬鈴薯莖葉中α-茄堿定量的測定：取各提取樣品溶液10 μL進樣，在最優(yōu)色譜條件下進行HPLC分析，測定α-茄堿含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

在190～400 nm波段對α-茄堿標準溶液進行紫外掃描，確定最大吸收峰波長為208 nm。當檢測波長為208 nm，柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min，流動相為乙腈/磷酸二氫鉀(30∶70，V/V)時，馬鈴薯莖葉中α-茄堿與其他峰都可得到分離。

2.2 標準曲線的擬合度

以確立的最優(yōu)色譜條件進行測定標準曲線值，以α-茄堿的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線得回歸方程：Y=7.21×105X+3.4×103，相關(guān)系數(shù)r=0.999。重復進樣5次，計算相對標準偏差(RSD)=0.57%（＜1%），表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3 標準品與馬鈴薯莖葉樣品中α-茄堿的定性分析

用HPLC測定標樣的α-茄堿，出峰時間和分離效果如圖1所示。從圖1可以看出，α-茄堿在確立的最優(yōu)色譜條件下的保留時間約4.755 min，分離較好。在確立的最優(yōu)色譜條件下進行HPLC分析，樣品及外標中的α-茄堿峰保留時間與α-茄堿標樣的基本重合，分別為4.765和4.772 min，并與其他組份達到了較好的基線分離。

圖1 α-茄堿標準品和樣品色譜圖Figure 1HPLC chromatogram of α-solanine standard and sample

表1 不同馬鈴薯品種莖葉中α-茄堿含量Table 1α-Solanine content in stem and leaf mixed samples of different potato varieties

2.4 馬鈴薯莖葉中α-茄堿的HPLC法測定

將1.3.1中制備好的5種樣液在確立的最優(yōu)色譜條件下測定，根據(jù)外標法計算其中的α-茄堿含量，結(jié)果見表1。

通過乙醇/乙酸混合提取，HPLC法測定5個馬鈴薯品種莖葉混合風干樣品中的α-茄堿含量，結(jié)果表明，5個品種中，晚熟品種‘隴薯7號’莖葉混合樣中的α-茄堿含量最高，早熟品種‘費烏瑞它’莖葉混合樣品中的α-茄堿含量最低。統(tǒng)計分析表明，參試品種間莖葉混合樣品的α-茄堿含量存在基因型差異，且差異水平達到極顯著水平。

2.5 回收率與精密度

稱取已測定了α-茄堿含量的正常馬鈴薯莖葉提取樣品，分別加入一定質(zhì)量的α-茄堿標準品，按樣品測定方法進行測定，見表2。結(jié)果顯示，該試驗回收率較高，總平均回收率為94.3%，因此檢測結(jié)果可靠。

將同一樣品取樣3次，進樣測定α-茄堿含量，做精密度實驗,測定結(jié)果見表3。5個馬鈴薯品種莖葉α-茄堿含量多次測定結(jié)果RSD＜1%，表明該方法精密度良好，測定值準確可靠。

表2 馬鈴薯莖葉中α-茄堿的回收率Table 2Collection ratio of α-solanine content in potato stem and leaf

表3 試驗結(jié)果的精密度(mg/g)Table 3Degree of precision for experimental results

3 討論

有研究表明，馬鈴薯莖葉具有較好的飼用價值，1 kg莖葉含有0.12個飼料單位，20～40 g可消化蛋白質(zhì)，80 mg胡蘿卜素，干物質(zhì)含量為18.4%，粗蛋白質(zhì)占干物質(zhì)的16.2%，粗纖維占干物質(zhì)的20.8%，粗脂肪占干物質(zhì)的1.8%，鈣含量為1.39%，磷含量為0.14%[6,8]。隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，會產(chǎn)生越來越多的馬鈴薯莖葉廢棄物而得不到有效利用，浪費了資源。然而馬鈴薯莖葉中含有有毒的α-茄堿，導致了莖葉適口性差，加上莖葉中含糖量少，水分含量高，難于保存利用，而且不同馬鈴薯品種及其起源、生育時期、器官、栽培和貯藏條件等均對植株中糖苷生物堿的含量存在很大影響。

不同品種（系）馬鈴薯龍葵素含量不同，這和本試驗證明馬鈴薯莖葉中龍葵素含量存在基因型差異的結(jié)果一致。同一品種的馬鈴薯若遭受機械損傷、變綠、蟲蛀、長芽和局部霉變等均會導致龍葵素含量的增加，研究表明，受傷可使塊莖龍葵素含量高出正常塊莖16倍之多[10]。韓俊清[8]研究表明，馬鈴薯莖葉經(jīng)干制后營養(yǎng)損失大，霉菌滋生，適口性更差。α-茄堿具有一定的光、熱穩(wěn)定性，光照會導致龍葵素增多，因而研究馬鈴薯莖葉中α-茄堿的含量變化可為其安全利用提供理論和技術(shù)支持。有研究表明對收獲后的馬鈴薯莖葉預(yù)干處理之后進行生物添加劑，如乳酸菌制劑、酶制劑等處理可以改善馬鈴薯莖葉青貯飼料品質(zhì)[11-14]，這對了解馬鈴薯莖葉中α-茄堿的含量變化和合理利用豐富的馬鈴薯資源提供了技術(shù)支撐。

本課題組成員目前正在開展對不同馬鈴薯品種莖葉進行生物制劑添加處理來研究對莖葉青貯飼料品質(zhì)的影響研究，初步發(fā)現(xiàn)對莖葉進行預(yù)干處理后添加乳酸菌和酶制劑后青貯飼料品質(zhì)較優(yōu)，對其中α-茄堿含量的變化影響如何有待進一步研究。

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HPLC Method for Determination of α-Solanine Content in Stem
and Leaf of Different Potato Varieties

LUO Aihua1＊,XU Meirong2,LU Liyin1,HU Xinyuan1,WEN Guohong1,XIE Kuizhong1
(1.Institute of Potato,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China;2.Institute of Agricultural Quality
Standards and Testing Technology,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China)

Stemandleafofpotatohavehighfeedingvalues,buthighcontentofα-solanineinpotatostemandleaf,which leads to poor palatability and difficulty in silage storage,is the main factor affecting utilization for potato stem and leaf. Understanding the content changes in α-solanine of stem and leaf could provide technical support for their safe use.After harvesting,stem and leaf of potato were dried and crushed,the mixed samples were extracted with ethanol acetic for α-solanine,and then high performance liquid chromatography(HPLC method)was used to determine its changes in different potatovarieties.Theresultsshowedthat theα-solaninecontentsofstemandleafin'Favorita','Kexin2','Longshu3','Longshu 6',and'Longshu7'were0.138,0.171,0.159,0.185and0.199mg/g,respectively.Theα-solaninecontentofstemsandleaves hasgenotypicdifference.

potato;variety;stem and leaf;α-solanine

S532

B

1672－3635（2014）06-0331-04

2014-09-19

甘肅省農(nóng)業(yè)科學院2012年青年基金（2012GAAS15-11）；甘肅省農(nóng)業(yè)科學院2012年科技創(chuàng)新項目（2012GAAS08）。

羅愛花（1977-），女，副研究員，主要從事馬鈴薯栽培及抗逆生理研究。

羅愛花，E-mail:florancehua@163.com。