毛細管氣相色譜法測定牛奶中的甜蜜素

楊盛春，張利剛，周 萍，何麗仙

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

毛細管氣相色譜法測定牛奶中的甜蜜素

楊盛春，張利剛，周 萍，何麗仙*

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：研究用毛細管氣相色譜法測定牛奶中甜蜜素含量的分析方法，通過對沉降劑用量、酯化時間等條件的優(yōu)化，降低方法的檢出限。方法：利用甜蜜素（環(huán)己基氨基磺酸鈉）在硫酸介質(zhì)中與亞硝酸鈉反應(yīng)后生成環(huán)己醇亞硝酸酯，用正己烷萃取，并用氣相色譜檢測環(huán)己醇亞硝酸酯的含量。結(jié)果：甜蜜素的線性范圍為0.05～0.4 mg∕mL，方法檢出限為2 μg，加標(biāo)回收率在99.4%～102.5%之間，RSD為1.4%。結(jié)論：該方法簡便、快捷、準確度高、重現(xiàn)性好，方法檢出限低，優(yōu)于GB∕T5009.97-2003法的4 μg檢出限。

甜蜜素；牛奶；氣相色譜法；毛細管柱

甜蜜素（環(huán)己基氨基磺酸鈉）是人工合成的甜味劑，經(jīng)研究結(jié)果表明甜蜜素有致癌的可能性，所以美國聯(lián)邦法律禁止甜蜜素用作食品添加劑〔1〕。在GB2760—1996《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準》中對甜蜜素的添加量作了明確的規(guī)定，乳飲料及蛋白飲料中添加的最高限量為0.65 g∕kg〔2〕。食品中甜蜜素的測定標(biāo)準是GB∕T5009.97-2003〔3〕，該標(biāo)準中測定甜蜜素的方法有氣相色譜法（采用填充柱）、比色法和薄層層析法〔4〕。牛奶中的蛋白質(zhì)有醇蛋白、乳白蛋白和乳球蛋白，這3種蛋白質(zhì)生理價值高、消化吸收好，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。牛奶因營養(yǎng)全面，而成為人們生活中的必需品。因此實時、快速、準確地檢測牛奶制品中的添加成分和物質(zhì)含量是提高乳制品質(zhì)量的首要條件。在檢測食品和飲料中的甜蜜素時GC∕FID已被廣泛應(yīng)用〔5-9〕，但由于在處理乳制品（高糖、高脂、高蛋白）的酯化過程中，易發(fā)生乳化現(xiàn)象，導(dǎo)致回收率偏低。因此本文試圖通過對沉降劑用量、酯化時間的優(yōu)化，減少酯化過程中的乳化現(xiàn)象，提高樣品的回收率，降低檢出限。

1 儀器與材料

1.1檢測條件進樣體積：1 μL；毛細管柱：ZBWAX；進樣口溫度：160.0℃；檢測器：FID；柱溫75℃；分流比：10∶1；載氣：氮氣；線速度：23.6 cm∕s；柱流量：0.8 mL∕min；H2流量：40 mL∕min；空氣流量：400 mL∕min。

1.2實驗儀器島津GC-2010plus氣相色譜；SPH-300氫氣發(fā)生器、SPH-3空氣發(fā)生器（上海儀電分析儀器有限公司）；AL204電子天平（上海有限公司）；AS20500BDJ超聲波清洗器；M37610-33CN渦旋器（Thermo Scientific）；LD4-2A離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。

1.3化學(xué)試劑甜蜜素標(biāo)準品（Supelco公司，色譜純）；沉降劑（同體積的100 g∕L乙酸鋅溶液+32 g∕L亞鐵氰化鉀），氯化鈉、正己烷、硫酸、亞硝酸鈉、無水硫酸鈉等試劑均為分析純。市售大理某品牌牛奶（出廠日期：2012年5月12日）。

2 試驗方法

2.1蛋白質(zhì)沉降精密稱取充分震蕩混合均勻后的試樣20.0 g于100 mL具塞比色管中，加入10 mL蒸餾水，再加入5 mL沉降劑（卡瑞試劑），蒸餾水定容至刻度，充分混勻，靜置30 min待蛋白質(zhì)沉降完全后，過濾，收集續(xù)濾液備用。

2.2酯化反應(yīng)待上述續(xù)濾液靜置澄清后，精密移取20 mL于100 mL具塞比色管中，加入10 mL蒸餾水，加入50 g∕L亞硝酸鈉溶液和100 g∕L硫酸各5 mL，充分混勻，放入冰箱，靜置30 min，然后準確加入10 mL正己烷和5 g氯化鈉，漩渦器上充分震蕩1 min，靜置，待有機相與水相分層后，離心分離，有機層經(jīng)無水硫酸鈉脫水，取適量于進樣瓶中，進樣分析，以峰面積外標(biāo)法定量。

2.3對照品溶液制備精密稱取甜蜜素標(biāo)準品50 mg于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，即得1.0 mg∕mL的標(biāo)準溶液。

3 結(jié)果與分析

3.1色譜圖甜蜜素標(biāo)準色譜圖見圖1。

圖1 甜蜜素色譜圖

3.2沉降劑用量的選擇分別精密稱取20.0 g震蕩混合均勻后的試樣6份，于6支100 mL具塞比色管中，加入10 mL蒸餾水，準確移取5.0 mL甜蜜素標(biāo)準品（1.0 mg∕mL）于上述樣品中，分別加入卡瑞試劑：0、1、3、5、7、10 mL，蒸餾水定容至刻度，充分混均，靜置30 min待蛋白質(zhì)沉降完全后，過濾，收集續(xù)濾液。精密移取20 mL按“2.1.2”處理樣液，并按“1.1”色譜條件進樣測定。見表1。實驗結(jié)果表明未加入卡瑞沉降劑的樣品不能沉降蛋白質(zhì)，正己烷與水相也不能分層，有機相呈乳白色無法進樣測定，試驗中以加入5 mL卡瑞試劑時蛋白質(zhì)沉降最徹底，提取液經(jīng)離心后液體清澈，酯化過程不發(fā)生乳化現(xiàn)象，有機相與水相分層明顯，且峰面積最大。

表1 不同量卡瑞試劑對應(yīng)的峰面積

3.3酯化時間優(yōu)化試驗還對最佳酯化反應(yīng)時間進行了探討，精稱20.00 g的樣品5份，于5支100 mL具塞比色管中，準確移取5.0 mL甜蜜素標(biāo)準品（1.0 mg∕mL）于上述樣品中，按“2.1.1”步驟處理樣品，得靜置澄清液，精密移取上述靜置液20 mL于100 mL具塞比色管中，加入10 mL蒸餾水，加入50 g∕L亞硝酸鈉溶液和100 g∕L硫酸各5 mL，充分混合均勻，放入冰箱10、20、30、40、50 min，取出后按“2.1.2”項自“準確加入10 mL正己烷和5 g氯化鈉”起處理樣品，并按“1.1”檢測條件進行測定，以峰面積定量。見表2。

表2 酯化時間對應(yīng)的峰面積

實驗結(jié)果表明，起初反應(yīng)劇烈，已得到大部分酯化產(chǎn)物，隨著反應(yīng)時間增加，酯化產(chǎn)物緩慢增加，30 min達最大值，隨反應(yīng)時間延長終產(chǎn)物反而降低。因此，本實驗選酯化時間為30 min。

3.4線性范圍與檢出限取濃度為1 mg∕mL的對照品溶液適量，配置濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 mg∕mL系列標(biāo)準溶液，按“2.1.2”步驟處理，按“1.1”檢測條件，由低到高濃度依次進樣（每個濃度各進樣2次，取平均值），以甜蜜素濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準工作曲線，在0.05～0.4 mg∕mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=165 596.4X+201.65，r=0.999 4（n=6）。

當(dāng)信噪比S∕N=3時，該方法的方法檢出限為2 μg，高于GB∕T5009.97-2003中的4 μg，說明此方法遠優(yōu)于國標(biāo)。

3.5精密度按“1.1”檢測條件，重復(fù)測定添加5.0 mL標(biāo)準溶液并按“2.1.1”、“2.1.2”處理的樣品6次，得RSD為2.7%，結(jié)果表明相對標(biāo)準偏差小于5%，能滿足分析化學(xué)的要求。

3.6穩(wěn)定性試驗按“1.1”檢測條件，每日測定“3.5”項處理好的樣品液。見表3。結(jié)果表明：標(biāo)準溶液可穩(wěn)定3 d，隨天數(shù)的增加，出現(xiàn)的雜質(zhì)峰也逐漸增加。

表3穩(wěn)定性試驗

3.7回收率稱取大理某品牌的甜牛奶（未檢出甜蜜素）6份樣品，按表4加入甜蜜素標(biāo)準液5 mL（1 mg∕mL）。按“2.1.1”、“2.1.2”處理樣品，并按“1.1”檢測條件測定，計算加標(biāo)回收率。由表4可知回收率在99.4%～102.5%之間。

表4 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果（n=6）

4 討論

牛奶中蛋白質(zhì)的存在會加劇酯化過程中的乳化現(xiàn)象，使有機相與水相不易分層，而卡瑞是一種廣泛使用的沉降劑，能很好的消除酯化過程中的乳化現(xiàn)象，且卡瑞試劑不出峰，故不影響分析測定。高溫會導(dǎo)致酯化反應(yīng)過程中生成的亞硝酸分解，不利于酯化反應(yīng)的進行，故酯化反應(yīng)時必須放置在0℃冰箱中。本文通過沉降劑用量、酯化時間等實驗條件的優(yōu)化，消除了甜蜜素測定過程中的乳化現(xiàn)象，提高了樣品的回收率和方法的檢出限，檢出限優(yōu)于國標(biāo)法。

〔1〕蘇揚，張聰.甜蜜素及檢測方法〔J〕.江蘇調(diào)味副食品，2011，28（1）:12.

〔2〕GB2760—1996，食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準〔S〕.北京:中國標(biāo)準出版社，2005.

〔3〕GB∕T 5009.97-2003，食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定〔S〕.北京:中國標(biāo)準出版社，1997.

〔4〕鄭建仙.高效甜味劑和甜味抑制劑的市場現(xiàn)狀與發(fā)展展望〔J〕.食品與機械，2006，22（1）:2-3.

〔5〕管華玫，宋志敏.毛細管柱氣相色譜法測定食品中甜蜜素〔J〕.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，3（19）:524-525.

〔6〕梅文泉，黎其萬，汪祿祥，等.毛細管柱氣相色譜法測定食品中甜蜜素含量〔J〕.西南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2009，31（1）:78-81.

〔7〕張均媚，劉偉娟，薛剛.含乳飲料中甜蜜素的測定〔J〕.食品研究與開發(fā)，2005，26（1）:136-137.

〔8〕陳麗萍，鄧遠玲.雪糕中環(huán)己基氨基磺酸鈉的氣相色譜測定法〔J〕.職業(yè)與健康，2004，20（3）:31-32.

〔9〕岳志堅.毛細管氣相色譜法測定白酒中甜蜜素〔J〕.理化檢驗:化學(xué)分冊，2008，44（8）:785-787.

*通信作者：何麗仙，副教授.

（責(zé)任編輯 毛本勇）

The Application of Capillary Gas Chromatography in Determination of Sodium Cyclamate in Milk

YANG Shengchun,ZHANG Ligang,ZHOU Ping,HE Lixian*
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the analysis method of capillary gas chromatography in determination of sodium cyclamate content in milk and to lower the detection limit of the method by optimizing the settling agent dosage,esterification time and other conditions.Methods:Sodium cyclamate reacted in the medium of sulfuric acid with sodium nitrite and cyclohexanol nitrite was produced and extracted with n-hexane,and its content was determined by capillary gas chromatography.Results:Linear range was from 0.05 to 0.4 mg∕mL,the detection limit was 2 μg,recovery of standard addition was 99.4%-102.5%,and RSD was 1.4%.Conclusion:The method was simple,rapid and accurate,with good reproducibility and low detection limit,much better than detection limit of 4 μg by GB∕T5009.97-2003 method.

sodium cyclamate;milk;gas chromatography;capillary column

TS201.6

A

1672-2345（2014）08-0057-03

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.08.019

2013-12-25

2014-03-06

楊盛春，講師，主要從事光譜分析、有機合成研究.