結(jié)核分枝桿菌MTB8.1蛋白自誘導(dǎo)發(fā)酵研究

聶 恒，高志芳，吳利先*

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.北京四環(huán)科寶制藥有限公司，北京 100070）

結(jié)核分枝桿菌MTB8.1蛋白自誘導(dǎo)發(fā)酵研究

聶 恒1，高志芳2，吳利先1*

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.北京四環(huán)科寶制藥有限公司，北京 100070）

目的：初步摸索出一條適合工業(yè)化開發(fā)、高效的、可溶表達(dá)結(jié)核分枝桿菌MTB8.1蛋白的發(fā)酵工藝。方法：利用菌株pUC18∕MTB8.1∕DH10B為發(fā)酵株，通過對培養(yǎng)基組成和發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)研究，從而獲得一全新的發(fā)酵工藝。結(jié)果：重組結(jié)核分枝桿菌MTB8.1蛋白通過本發(fā)酵工藝的表達(dá)，單位體積發(fā)酵液可溶性蛋白的產(chǎn)量大幅提高，每升發(fā)酵液純化得到可溶性蛋白約30 mg左右。結(jié)論：初步摸索出一條較好的MTB8.1在大腸埃希菌系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)的途徑，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。

結(jié)核分枝桿菌；MTB8.1蛋白；可溶性表達(dá)；發(fā)酵工藝；抗原性

結(jié)核在全世界范圍內(nèi)仍然是最具威脅的傳染病之一，近年來許多國家結(jié)核的發(fā)病率增高，我國每年新增感染人數(shù)多達(dá)130萬，成為單一致病菌引起死亡率最高的傳染病〔1-4〕。且自20世紀(jì)80年代以來艾滋病在全世界范圍內(nèi)的播散，結(jié)核的發(fā)病率也隨之快速上升，人類免疫缺陷病毒結(jié)核分枝桿菌（Human immunodeficiency virus-Tuberculo?sis，HIV-TB）復(fù)合感染的結(jié)核病患者的比例升高，而且嚴(yán)重影響了復(fù)合感染者的生命質(zhì)量，同時(shí)也是復(fù)合感染者的一個(gè)重要致死原因〔5-10〕。所以目前需一種針對復(fù)合感染者結(jié)核感染檢測的快速有效的診斷方法。由于復(fù)合感染者自身的免疫特點(diǎn)，傳統(tǒng)的結(jié)核菌素試驗(yàn)受到了限制，目前基于血清學(xué)的抗原檢測是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。Ray?mond等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)在HIV-TB復(fù)合感染的人群中，用MTB8.1蛋白抗原檢測比單用TbF6和DPEP檢測其靈敏度提高23.8%，若用TbF6-DPEPMTB8.1聯(lián)合檢測其靈敏度提高37.5%。因此在感染HIV的高危人群中檢測對抗MTB8.1的抗體，可以作為未出現(xiàn)臨床癥狀但已感染結(jié)核的診斷標(biāo)志，讓患者可以從早期治療中受益。這與Hen?dricksom等〔12〕和Lall等〔13〕的研究發(fā)現(xiàn)相符。目前以大腸埃希菌為宿主的原核表達(dá)系統(tǒng)往往會形成大量包涵體表達(dá)，復(fù)性后蛋白活性低且復(fù)性率也很低。本研究中，我們通過對培養(yǎng)基的組成以及相應(yīng)的發(fā)酵工藝進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，實(shí)現(xiàn)了MTB8.1的高效可溶性表達(dá)，為以后的工業(yè)化放大開辟了新的途徑。

1 材料與方法

1.1菌種克隆載體pUC18∕MTB8.1∕DH10B由大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室保存。

1.2主要試劑酸水解干酪素、酵母提取物購自Sigma公司；其它試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司；所用抗體為大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室保存血清樣本；結(jié)核陽性血清和陰性血清由云南省大理州疾病預(yù)防控制中心提供。

1.3培養(yǎng)基組成研究培養(yǎng)基參照Studier方法優(yōu)化〔14〕，培養(yǎng)基基本組成:2.5%酸水解干酪素、1.0%酵母提取物、50 mmol∕L PB（pH值7.4）、1.0%甘油、0.1%葡萄糖、0.2%α-乳糖。發(fā)酵條件選用：1 000 mL三角瓶，裝料400 mL，搖床轉(zhuǎn)數(shù)200 r∕min，種子過夜培養(yǎng)16 h，接種量1 000:2（V/V），培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，菌體重懸后，超聲破碎，然后離心棄沉淀，上清經(jīng)Ni-親和層析純化，超濾濃縮。通過改變甘油的濃度、葡萄糖的濃度、乳糖濃度、磷酸鹽緩沖液濃度，觀察對單位體積發(fā)酵液菌體重量和可溶性目的蛋白產(chǎn)量的影響。

1.4發(fā)酵工藝研究發(fā)酵條件選用：1 000 mL三角瓶，裝料400 mL。培養(yǎng)基選用“1.3”項(xiàng)下篩選出的最適單因素組合培養(yǎng)基，離心收集菌體，菌體重懸后，超聲破碎，然后離心棄沉淀，上清經(jīng)Ni-親和層析純化，超濾濃縮；通過研究種子生長曲線，確定種子培養(yǎng)時(shí)間；改變表達(dá)溫度、表達(dá)時(shí)間、溶氧條件，分析收菌量及目的蛋白表達(dá)水平。

1.5 ELISA檢測采用間接法，將純化的結(jié)核分枝桿菌rMTB8.1蛋白（1 μg∕mL）包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜；用PBST洗滌后加入1∶1 000稀釋的待檢血清，37℃溫育1 h，再用PBST洗滌；加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG，37℃溫育1 h；再用PBST洗滌，加入鄰苯二胺和雙氧水底物顯色30 min，以2 mol∕L硫酸終止反應(yīng)。以空白對照調(diào)校零點(diǎn)，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm的OD值，取2孔平均值作為終結(jié)果，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基的組成對發(fā)酵的影響

2.1.1 甘油的含量對發(fā)酵的影響 甘油作為一種簡單碳源，對促進(jìn)高密度發(fā)酵影響很大，培養(yǎng)基中含有一定濃度的甘油時(shí)能夠在一定程度上促進(jìn)本菌株高密度發(fā)酵，當(dāng)其含量為1%時(shí)，其發(fā)酵密度和目的蛋白的產(chǎn)量是最高的。見圖1。

圖1 甘油含量對發(fā)酵的影響

2.1.2 α-乳糖的含量對發(fā)酵的影響 一定濃度的α-乳糖能夠促進(jìn)菌體的高密度培養(yǎng)，但是目的蛋白的產(chǎn)量卻呈現(xiàn)下降的趨勢，甘油含量在0.8%左右時(shí)，本菌株的發(fā)酵密度是最高的，但是隨著甘油含量的增加每升發(fā)酵液的目的蛋白的產(chǎn)量從32 mg下降至28 mg左右。見圖2。

圖2 α-乳糖含量對發(fā)酵的影響

2.1.3 葡萄糖的含量對發(fā)酵的影響 一定濃度的葡萄糖可以促進(jìn)細(xì)菌高密度表達(dá)，同時(shí)可以降低其本底表達(dá)，0.4%的葡萄糖是最適宜本菌株高密度表達(dá)的，但是最適合目的蛋白表達(dá)的葡萄糖濃度在0.2%左右，綜合目的蛋白產(chǎn)量和成本因素，選0.2%的葡萄糖作為培養(yǎng)基的最適濃度。見圖3。

圖3 葡萄糖含量對發(fā)酵的影響

2.1.4 PB緩沖液的濃度對發(fā)酵的影響 高密度發(fā)酵過程中，由于產(chǎn)酸量較大，所以在培養(yǎng)基中加入適量的緩沖液，有利于穩(wěn)定培養(yǎng)基的pH值，通過緩沖溶液可以將pH值穩(wěn)定在6～7之間，發(fā)現(xiàn)本菌株生長情況相差不大，但是PB緩沖液濃度在20 mmol∕L時(shí)目的蛋白產(chǎn)量最高。見圖4。

圖4 PB緩沖液濃度對發(fā)酵的影響

2.2表達(dá)條件對發(fā)酵的影響

2.2.1 種子MTB8101生長曲線 從斜面挑取菌落接種于LB培養(yǎng)基中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間取樣，測定菌體濃度，接種時(shí)種子液要有一定濃度和較高菌體活力，可以看出，培養(yǎng)8～10 h的菌體處于對數(shù)期生長中前期，活性很高，且濃度較高適宜接種擴(kuò)大培養(yǎng)。見圖5。

圖5 種子MTB8101生長曲線

2.2.2 表達(dá)時(shí)間對發(fā)酵的影響 相對于IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，自誘導(dǎo)發(fā)酵所需要的時(shí)間較長，表達(dá)20 h時(shí)目的蛋白產(chǎn)量是最高的，同時(shí)發(fā)現(xiàn)菌體的產(chǎn)量和目的蛋白產(chǎn)量沒有相關(guān)性。見圖6。

圖6 表達(dá)時(shí)間對發(fā)酵的影響

2.2.3 表達(dá)溫度對發(fā)酵的影響 從24～38℃溫度區(qū)間，菌體產(chǎn)量和溫度隨溫度的升高而增加，目的蛋白產(chǎn)量和溫度升高呈正相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)表達(dá)溫度上升到30℃后明顯提升，然后緩慢增加，37℃表達(dá)量最高。見圖7。

圖7 表達(dá)溫度對發(fā)酵的影響

2.2.4 溶氧條件對發(fā)酵的影響 由于實(shí)驗(yàn)室條件限制，本實(shí)驗(yàn)僅從改變搖床轉(zhuǎn)速，來研究溶氧對本發(fā)酵體系的影響，溶氧條件對本實(shí)驗(yàn)體系菌體產(chǎn)量和目的蛋白產(chǎn)量影響不大，但是，結(jié)果發(fā)現(xiàn)搖床轉(zhuǎn)速在180～200 r∕min時(shí)，菌體產(chǎn)量和目的蛋白產(chǎn)量相對高一些。

3 ELISA檢測結(jié)果

ELISA檢測結(jié)核病患者血清標(biāo)本，分別檢測陽性組和正常人血清標(biāo)本。結(jié)果判斷，以樣品稀釋液作為空白對照，讀取OD450值，陽性值：陰性值≥2.1，判讀為陽性。85例肺結(jié)核病患者血清中檢出陽性27例，陽性率31.7%；40例非結(jié)核肺部感染患者血清中檢出陽性3例，陽性率7.5%；10例健康對照血清均為陰性。該方法的敏感性為31.7%、特異性為92.5%，符合率51.2%。

4 討論

分子生物學(xué)已發(fā)展到后基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)的時(shí)代，高通量地表達(dá)可溶性蛋白是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，傳統(tǒng)的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)不但操作繁瑣，同時(shí)包涵體經(jīng)常會出現(xiàn)，文獻(xiàn)〔15〕報(bào)道，原核表達(dá)的MTB8.1重組蛋白，大部分為包涵體表達(dá)，復(fù)性得率很低，并且復(fù)性得到目的蛋白活性也較低，很難被廣泛應(yīng)用，因此支持MTB8.1可溶性表達(dá)的培養(yǎng)基組成成分及其發(fā)酵工藝參數(shù)的研究，是生產(chǎn)高活性、可溶性好的MTB8.1蛋白前提，也是實(shí)現(xiàn)MTB8.1工業(yè)化生產(chǎn)的亟待解決的課題。本研究通過對其培養(yǎng)基主要成分和主要發(fā)酵工藝參數(shù)的單因素實(shí)驗(yàn)，初步建立了基礎(chǔ)發(fā)酵工藝，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些問題，需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究論證。首先，培養(yǎng)大腸埃希菌使用的培養(yǎng)基，組成成分簡單，不能滿足高密度發(fā)酵對營養(yǎng)的要求，本研究將基礎(chǔ)碳氮源的主要成分進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化，對其含量進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶岣?，大大提高了該菌株的發(fā)酵密度，為提高目的蛋白的產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)；其次，由于代謝物阻遏效應(yīng)大腸埃希菌在耗盡外源葡萄糖之前不會誘發(fā)Lac操縱子，我們在培養(yǎng)基中加入一定量的葡萄糖就可以阻止非目的性的誘導(dǎo)表達(dá)；第三，為了減少高密度培養(yǎng)而產(chǎn)酸過多對培養(yǎng)基過酸的影響，初步摸索出了的適宜的磷酸緩沖液的濃度，對穩(wěn)定整個(gè)發(fā)酵過程培養(yǎng)基的酸堿環(huán)境至關(guān)重要；第四，培養(yǎng)基代謝分解乳糖處于較低濃度已經(jīng)足夠誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，無需再額外加入乳糖；第五，通過研究發(fā)現(xiàn)本菌株的最適宜培養(yǎng)溫度為37℃，可能是本載體的表達(dá)速度本來就慢，不宜表達(dá)包涵體，因此在較高的溫度時(shí)適宜其表達(dá)；第六，我們選用了處于對數(shù)生長前期的種子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，保證了種子的活力和濃度，為實(shí)現(xiàn)高密度表達(dá)奠定了基礎(chǔ)；第七，由于實(shí)驗(yàn)條件的影響，實(shí)驗(yàn)通過改變搖床的轉(zhuǎn)速來研究溶氧對其發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)180 r∕min時(shí)目的蛋白產(chǎn)率最高，因此適宜的溶氧條件對本菌株的發(fā)酵也是至關(guān)重要的；第八，實(shí)驗(yàn)將目的蛋白基因序列插入pUC18的Lac Z基因，運(yùn)用載體Lac Z自身的表達(dá)元件進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，使其表達(dá)速度更傾向于可溶性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。我們通過對培養(yǎng)基的調(diào)整和發(fā)酵工藝的優(yōu)化，初步摸索出一條較好的MTB8.1在大腸埃希菌系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)的途徑，但是，由于時(shí)間有限，本研究僅對本菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基主要組成和主要發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了簡單單因素實(shí)驗(yàn)，還沒有對其進(jìn)行系統(tǒng)的多因素交叉實(shí)驗(yàn)，需要后續(xù)相關(guān)研究，為實(shí)現(xiàn)MTB8.1在大腸埃希菌系統(tǒng)中高效、可溶表達(dá)提供更加系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)。

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*通信作者：吳利先，教授，博士.

（責(zé)任編輯 李 楊）

The Study of Auto-inducing Fermentation of Mycobacterium tuberculosis Protein MTB8.1

NIE Heng1,GAO Zhifang2,WU Lixian1*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.SHKB Pharmaceutical Co.,Ltd.,Beijing 100070,China）

Objective:To explore an effective fermentation process of Mycobacterium tuberculosis protein MTB8.1 with soluble expression,which would be suitable for industrial development.Methods:Strain pUC18∕MTB8.1∕DH10B was used as fermentation strain and a systematic study of the composition of medium and the parameters of fermentation was conducted to obtain a new fermentation process.Results:By means of the new fermentation process,the yield of soluble recombinant protein MTB8.1 was greatly increased in per unit volume of fermentation broth,with about 30 mg of soluble protein obtained from every liter of fermentation broth through purification.Conclusion:A better way of soluble expression of MTB8.1 in Escherichia coli expression system was found tentatively,which laid the theoretical foundation for the industrial production.

Mycobacterium tuberculosis;protein MTB8.1;soluble expression;fermentation process;antigenicity

Q71

A

1672-2345（2014）08-0018-05

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.08.006

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260456）

2014-02-24

2014-03-19

聶恒，碩士研究生，主要從事感染與免疫學(xué)研究.