云南松松塔抗HIV-1活性提取物急性毒性實驗研究

史志婷，劉 熙，張海珠*

（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000）

云南松松塔抗HIV-1活性提取物急性毒性實驗研究

史志婷1，2，劉 熙1，2，張海珠1，2*

（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000）

目的：研究云南松松塔抗HIV-1活性提取物的急性毒性，對其用藥安全性進行初步評價。方法：急性毒性實驗采用最大給藥量法，松塔提取物一次灌胃給藥25 g∕kg，觀察小鼠在14 d內(nèi)毒性表現(xiàn)，14 d后測量小鼠體重，臟器質(zhì)量并對肝臟和腎臟作病理組織學(xué)檢查。結(jié)果：急性毒性實驗未見明顯毒性。空白組與給藥組各臟器指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，病理檢查結(jié)果各組均未見異常。結(jié)論：本次實驗結(jié)果顯示，松塔活性提取物未見急性毒性反應(yīng)。

松塔；抗HIV-1；急性毒性

松塔是松科松屬植物的果實，《本草綱目》記載其性溫、味苦，能祛風(fēng)、祛痰止咳、平喘、滋潤腸道和安神，主治氣管炎、咳嗽有痰、哮喘等癥〔1〕。松塔被1997年中國藥典所收錄。松屬植物共有近百種，我國有近50種，云南主產(chǎn)云南松、喬松、馬尾松、思茅松、華山松等〔2〕。隨著現(xiàn)代實驗研究的深入開展，發(fā)現(xiàn)松塔中含有糖、木質(zhì)素、二萜、黃酮、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分〔3-7〕，具有很多藥理活性，如抗癌、抗菌、抗病毒類〔8-9〕。本課題組前期試驗表明云南松松塔提取物具有很好的抗HIV-1活性，在抗HIV-1方面有著很大的藥用價值和臨床應(yīng)用前景，但對于該松塔提取物的毒性研究還未見報道。本文對松塔提取物的急性毒性進行研究，對其用藥安全性進行評價，為進一步開發(fā)利用該資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物昆明種小鼠，體重（20±2）g，雌雄各半，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號為SCXK（滇）2011-0004。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫：20℃，相對濕度：50%～60%，光照時間：12∕12 h。

1.2云南松松塔提取物的制備云南松松塔粗粉10 kg用85%乙醇提取2次，每次用乙醇4 000 mL，浸泡24 h。過濾，將殘渣用熱水提取，過濾除去熱水提取液。在室溫條件下，向殘渣中加堿液進行提取并過濾得到堿性提取液。用醋酸調(diào)所得堿性提取液的pH值至5，濃縮、過濾，濾液用乙醇分級沉淀，制成凍干粉備用。

1.3儀器與設(shè)備全自動脫水機（TP1020 LEICA，德國）；生物組織包埋機（BM-V孝感市電子儀器廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（101-1-BS）；石蠟切片機和圖像分析系統(tǒng)（LEICA-Q550CW，德國LEICA公司）。

1.4急性毒性實驗先進行半數(shù)致死量（LD50）測定預(yù)試驗，發(fā)現(xiàn)在最大給藥濃度和最大給藥體積下，未見動物出現(xiàn)死亡。所以進行最大給藥量法〔10-15〕，小鼠20只，雌雄各半，隨機分為2組，對照組和給藥組。給藥組小鼠禁食約12 h，3次∕d灌胃松塔提取物0.04 mL∕g，給藥劑量為25 g∕kg；對照組給予相同體積分數(shù)的重蒸水。仔細觀察并記錄給藥后即刻至14 d內(nèi)小鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng)與死亡情況。比較各組臟器指數(shù)，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。取肝、腎做病理組織檢查。

2 實驗結(jié)果

2.1一般情況觀察14 d內(nèi)對小鼠的飲水、進食、排泄、皮毛、自由活動等情況的觀察發(fā)現(xiàn)，各組動物飲水、飲食正常，眼、口、鼻處無異常分泌物，糞便成形無黏液，耳、鼻、尾部未見發(fā)紺，亦無蒼白、潮紅現(xiàn)象，被毛光潤致密，呼吸、活動正常。給藥期間無動物死亡，未見毒性反應(yīng)。

2.2松塔提取物對小鼠臟器系數(shù)的影響松塔提取物對小鼠的各臟器系數(shù)與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.1）。見表1。

表1 松塔提取物對小鼠臟器系數(shù)的影響（xˉ±s）

2.3肉眼尸檢各組小鼠解剖肉眼觀察：心臟大小正常，表面光亮，心包膜內(nèi)無積液；雙肺表面無充血、出血及粘連；腎臟紅褐色，皮髓質(zhì)分界清楚，無水腫、充血等病變；脾臟暗紅質(zhì)軟，大小正常，表面無皺紋；胃黏膜無充血、出血、潰瘍；其余胸腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮等亦未見明顯異常。

2.4病理組織學(xué)檢查給藥14 d后，對2組小鼠的肝和腎做HE染色切片，病理檢查未見異常。結(jié)果表明，肝臟包膜完整無損傷。肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索排列有序，細胞無水腫、脂變、壞死，中央靜脈及肝血竇無充血擴張，枯否氏細胞無明顯增生；小葉內(nèi)及匯管區(qū)無炎細胞浸潤，未見瘀膽。腎臟切片表明：腎臟皮、髓質(zhì)分布清楚，皮質(zhì)內(nèi)腎小球體積及細胞數(shù)正常，無壞死、玻璃樣變及纖維化等病變。小球毛細胞血管內(nèi)皮細胞無增生、腫脹、基底膜無蛋白性物質(zhì)沉積。腎小管結(jié)構(gòu)正常，上皮細胞無變性、壞死、脫落，管腔未見狹窄，腔內(nèi)無蛋白、細胞管型。腎髓質(zhì)及間質(zhì)、腎盂均未見病理性損傷及炎性病變。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟、腎臟組織學(xué)變化（HE，×100）

3 討論

近年來，云南松松塔的藥用價值逐漸得到人們的重視，本實驗室前期大量的實驗表明松塔提取物在抗HIV-1病毒方面作用突出，具有治療艾滋病的潛在價值。利用松塔資源開發(fā)具有抗HIV-1活性的藥物既可以為艾滋病患者帶來福音，又能充分利用云南這一特有的地域品種優(yōu)勢〔16-21〕。本次實驗結(jié)果證實，在給定的用藥劑量下，松塔提取物對小鼠無急性毒性，表明云南松松塔提取物是一種安全的天然植物提取物，這為其今后的開發(fā)利用奠定了毒理學(xué)基礎(chǔ)。本次實驗結(jié)果中胸腺指數(shù)略有增加，這可能與松塔具有免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)〔2〕，有待進一步研究。

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*通信作者：張海珠，講師.

（責(zé)任編輯 李 楊）

Experimental Study on Acute Toxicity of Anti-HIV-1 Active Extracts from Pinecone of Pinus yunnanensis

SHI Zhiting1,2,LIU Xi1,2,ZHANG Haizhu1,2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000，China;2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study acute toxicity of anti-HIV-1 active extracts from pinecone of Pinus yunnanensis and to evaluate its medicinal safety.Methods:The maximum dosage test was used,and after intragastric administration of pinecone extracts in mice(25 g∕kg once)for14days,with acute toxicity observed during this period,the body weight and organ weight were measured and the histopathological examination on the liver and kidney was conducted.Results:The acute toxicity test showed no toxicity,the control group and the treatment group showed no significant difference statistically on organ index and pathological examination showed no abnormal results in each group.Conclusion:There was no acute toxicity reaction on anti-HIV-1 active extracts from pinecone.

pinecone;anti-HIV-1;acute toxicity

R285.5

A

1672-2345（2014）08-0004-03

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.08.002

國家自然科學(xué)基金資助項目（81260632）

2014-02-25

2014-05-06

史志婷，碩士研究生，主要從事中藥質(zhì)量控制研究.