五加科藥用植物懸浮培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

宋娟，雷秀娟，尹紅新，王英平

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春130112)

五加科(Araliaceae)藥用植物多分布在山林深處，其中不乏有多種名貴中藥材，如人參(PanaxginsengC.A.Mey.)、西洋參(P.quinquefoliumL.)、三七(P.notoginseng)、東北刺人參(OplopanaxelatusNakai)、刺五加(EleutherococcussenticosusMaxim.)和龍牙楤木[Araliaalata(Miq.)Seem.]等，具有抗衰老、降血脂、滋補(bǔ)、活血補(bǔ)氣、利脾補(bǔ)腎等作用[1]。但是由于該科藥用植物多數(shù)生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，使得對(duì)其形態(tài)學(xué)等基礎(chǔ)研究存在很大局限性。1964年，羅士韋等[2]對(duì)人參愈傷組織培養(yǎng)進(jìn)行研究，開(kāi)啟了五加科藥用植物離體培養(yǎng)的大門，這為解決五加科植物的形態(tài)發(fā)生、遺傳育種、種質(zhì)創(chuàng)新等研究提供了技術(shù)手段。從此，五加科藥用植物懸浮培養(yǎng)技術(shù)研究成為了該領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。

1 五加科藥用植物懸浮培養(yǎng)的特點(diǎn)

植物懸浮培養(yǎng)指在液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)細(xì)胞或組織等。植物細(xì)胞或組織懸浮培養(yǎng)不受季節(jié)、土壤等外界因素的影響，在培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞、懸浮不定根及毛狀根等生長(zhǎng)迅速、來(lái)源單一、遺傳穩(wěn)定、代謝產(chǎn)量高[3～5]，易于同步化，可以大大縮短生長(zhǎng)周期。五加科藥用植物懸浮細(xì)胞具有細(xì)胞易粘附聚集的特點(diǎn)，主要發(fā)生在細(xì)胞培養(yǎng)前期和對(duì)數(shù)后期，分別是由于前期迅速分裂的年幼細(xì)胞不能及時(shí)分開(kāi)及對(duì)數(shù)后期分泌的多糖和蛋白質(zhì)會(huì)使細(xì)胞相互粘附的結(jié)果。

2 影響五加科藥用植物懸浮培養(yǎng)的因素

2.1 生長(zhǎng)周期

五加科藥用植物懸浮培養(yǎng)的最適生長(zhǎng)周期一般為30d，周期基本呈“S”型。人參[6]、西洋參[7]等植物細(xì)胞0d～5d先進(jìn)入延遲期，10d～15d開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，人參細(xì)胞在第24天、西洋參細(xì)胞第30天左右時(shí)分別得到最大生長(zhǎng)量和皂苷含量；刺五加[8]的延滯期較長(zhǎng)，需0d～12d，第20天、第40天時(shí)分別得到生長(zhǎng)速率和最大生長(zhǎng)量，在進(jìn)入對(duì)數(shù)期后細(xì)胞量開(kāi)始增加，穩(wěn)定期后產(chǎn)量達(dá)到最大值。

2.2 接種細(xì)胞和初始接種量

五加科藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)一般選擇嫩黃色、質(zhì)地疏松、呈透明狀態(tài)的旺盛時(shí)期的愈傷組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，此類細(xì)胞處于快速生長(zhǎng)期，體積小、分裂快、易分散，適合建立懸浮培養(yǎng)系。初始接種量在建立懸浮培養(yǎng)體系時(shí)有重要作用，細(xì)胞接入量過(guò)多影響培養(yǎng)物增殖，會(huì)短期內(nèi)消亡；接入量少時(shí)，不利于培養(yǎng)物正常生長(zhǎng)。不同植物的初始接入量也不完全相同。例如王娟[9]對(duì)西洋參接種量進(jìn)行了研究，認(rèn)為接種量為25g/L～35g/L時(shí)利于西洋參細(xì)胞生長(zhǎng)，有最大細(xì)胞干重，隨著接種密度增加，細(xì)胞生長(zhǎng)率下降；低于20g/L的接種量時(shí)，細(xì)胞增殖受抑制。刺五加細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最佳接種密度為60g/L，培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)良好，并得到最大生長(zhǎng)量[8]。

2.3 pH

懸浮培養(yǎng)體系中，影響細(xì)胞生長(zhǎng)的一個(gè)重要參數(shù)是pH。一般五加科植物細(xì)胞或組織懸浮培養(yǎng)pH為5.8～6.0，也有人認(rèn)為pH在小范圍內(nèi)波動(dòng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響不大，但對(duì)次生代謝物的積累有很大影響。懸浮培養(yǎng)周期里，pH也隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝物的積累發(fā)生變化，進(jìn)入延滯期后pH下降，進(jìn)入對(duì)數(shù)期后開(kāi)始緩慢上升，直到穩(wěn)定期后pH迅速增加到最大值。

2.4 培養(yǎng)基成分

2.4.1基本培養(yǎng)基研究發(fā)現(xiàn)，在1/2 MS和MS培養(yǎng)基濃度時(shí)，能促進(jìn)人參細(xì)胞[10]、不定根的生長(zhǎng)，濃度過(guò)高則有抑制作用，其中MS培養(yǎng)基最有利于西洋參細(xì)胞生長(zhǎng)和皂苷積累；B5培養(yǎng)的細(xì)胞增殖率最低，但能促進(jìn)人參皂苷和多糖的合成；White、Fox、6，7-V等培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞增殖影響不大，但利于一些代謝產(chǎn)物的積累[9，11]。刺五加嫩葉愈傷組織懸浮培養(yǎng)時(shí)，在MS培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最好，40d細(xì)胞增殖6倍多，細(xì)胞團(tuán)增大明顯；B5稍差；1/2 MS長(zhǎng)勢(shì)最差，且有自溶現(xiàn)象[8]。

氮源是基本培養(yǎng)基中對(duì)五加科藥用植物懸浮培養(yǎng)影響最大的因素。氮源總濃度一定時(shí)，NO3-/NH4+的比值高，人參[12]、西洋參[13，14]、三七和刺五加[8]的生長(zhǎng)速率和細(xì)胞含量顯著增加；當(dāng)只有NO3-時(shí)，也有利于細(xì)胞生長(zhǎng)且皂苷和多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值；只有NH4+時(shí)或濃度高于20mmol/L時(shí)，人參細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，甚至不生長(zhǎng)。又有研究認(rèn)為，NO3-和NH4+同時(shí)存在時(shí)，人參懸浮細(xì)胞可獲得最大細(xì)胞生長(zhǎng)量[6]。

磷酸鹽對(duì)植物的細(xì)胞生長(zhǎng)有較大影響。東北刺人參不定根的鮮物重和干物重及增殖系數(shù)隨磷酸鹽濃度的增加，先增加后降低；當(dāng)濃度是正常MS培養(yǎng)基的濃度時(shí)獲得最大值[15]。當(dāng)磷濃度為1.04mmol/L時(shí)，人參細(xì)胞有最佳生長(zhǎng)；濃度為0.42mmol/L時(shí)，皂苷產(chǎn)量最高。西洋參的最佳細(xì)胞生長(zhǎng)濃度是0.65mmol/L，皂苷產(chǎn)量最高的濃度為1.25mmol/L[16]。三七[17]懸浮培養(yǎng)中，磷起始濃度增大明顯利于細(xì)胞生長(zhǎng)，2.5mmol/L時(shí)細(xì)胞達(dá)到飽和生長(zhǎng)量，3.75mmol/L可獲得最佳細(xì)胞培養(yǎng)和最大皂苷含量。

培養(yǎng)基中其他離子對(duì)五加科植物懸浮培養(yǎng)也有一定影響。Mg2+可以激活一些酶的活性，濃度為92.5mg/L時(shí)可以提高西洋參懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)速度；濃度為55.35mg/L的Ca2+可以促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)和皂苷產(chǎn)量的增加[18]。三七懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)，隨Cu2+濃度增加而增加；濃度低于25μmol/L的Cu2+對(duì)人參不定根無(wú)明顯作用。

2.4.2碳源糖不僅是培養(yǎng)液中碳源的主要來(lái)源，還有維持培養(yǎng)基滲透壓的作用。糖濃度過(guò)低，不足以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝和維持滲透壓的需要；過(guò)高的糖量導(dǎo)致細(xì)胞失水，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。蔗糖是建立五加科懸浮體系最常用的碳源，與葡萄糖和果糖相比，蔗糖和白糖更利于東北刺人參不定根的鮮物重和干物重的增加[15]。在刺五加[8]懸浮培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，糖濃度對(duì)細(xì)胞生物量的積累趨勢(shì)無(wú)明顯影響，但在高、低濃度時(shí)，分別導(dǎo)致細(xì)胞死亡、干重下降和生長(zhǎng)緩慢；在中、高濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，干重率明顯增加，糖最適濃度為40g/L。30g/L～50g/L蔗糖時(shí)，人參細(xì)胞快速生長(zhǎng)，有最大生長(zhǎng)量；40g/L蔗糖濃度對(duì)三七細(xì)胞生長(zhǎng)有利，但超過(guò)60g/L時(shí)抑制生長(zhǎng)[10，17，19]。

2.4.3激素植物激素對(duì)五加科藥用植物的懸浮培養(yǎng)至關(guān)重要，因而對(duì)不同激素濃度的篩選十分必要。Choi等[20]發(fā)現(xiàn)，刺五加胚性愈傷組織在不含2，4-D的MS液體培養(yǎng)基中比含4.5μM 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基上更易誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚。龍牙楤木細(xì)胞培養(yǎng)在含1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2，4-D的MS液體培養(yǎng)基中會(huì)大量增殖，且生活力強(qiáng)[21]。IBA可促進(jìn)人參、西洋參等懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和皂苷積累；2，4-D有利于人參、西洋參[22]、三七、刺五加等細(xì)胞的生長(zhǎng)；NAA能促進(jìn)人參發(fā)狀根的生長(zhǎng)，IBA利于細(xì)胞、發(fā)狀根生長(zhǎng)。人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，激素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)量的影響效果均依次為2，4-D>NAA>BA>KT，7mg/L的IBA與BA或KT混用時(shí)，可以促進(jìn)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)[23]。有利于三七細(xì)胞生長(zhǎng)的2，4-D濃度是0.5mg/L～1.0mg/L，也可以提高皂苷含量；NAA和IAA都會(huì)抑制竹節(jié)參(PanacisJaponiciRhizoma)發(fā)根的生長(zhǎng)，干重、濕重比明顯降低，而IBA則有促進(jìn)作用[24]。

2.5 誘導(dǎo)子對(duì)五加科懸浮培養(yǎng)的影響

誘導(dǎo)子指能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的物質(zhì)。從來(lái)源上可分為生物和非生物誘導(dǎo)子。生物誘導(dǎo)子包括多種P(真菌、細(xì)菌、病毒和酵母)，非生物誘導(dǎo)子包括水楊酸、寡糖素、茉莉酸甲酯、前體、溫度等[25]。

2.5.1生物誘導(dǎo)子誘導(dǎo)子在人參不定根[26]等組織中作用24h后，可提高皂苷等活性物質(zhì)含量；經(jīng)刺盤飽菌絲體處理的西洋參細(xì)胞，總皂苷產(chǎn)率提高1.3倍；黑曲霉可增加細(xì)胞多糖含量達(dá)1倍多[27]。方綺民等[28]發(fā)現(xiàn)，6種真菌菌絲體能促進(jìn)西洋參懸浮細(xì)胞的皂苷合成，作用最明顯的是葡枝根霉菌絲體。

劉峻等[29]發(fā)現(xiàn)，黃瓜炭疽病菌、青菜炭疽病菌、棉花枯萎病菌及黑曲霉中提取的真菌誘導(dǎo)子對(duì)人參毛狀根某些皂苷的合成具有特異性，能促進(jìn)次生代謝物的定向積累，還對(duì)生物量有影響。如黑曲霉多糖誘導(dǎo)子濃度為20mg/L時(shí)，可以促進(jìn)毛狀根生長(zhǎng)和總皂苷含量增加，單體皂苷Rg2和Rb1含量增加，未檢測(cè)出Rg1和Re。

初旸[8]利用從土壤中分離的黃瓜炭疽、番茄灰霉、編號(hào)2020、編號(hào)2006及編號(hào)2014的5種真菌作為誘導(dǎo)子(后3種為未知菌種)，考察對(duì)刺五加愈傷懸浮系的影響。結(jié)果表明，5種真菌誘導(dǎo)子均可使培養(yǎng)基pH上升；黃瓜炭疽、2020和2014輕微抑制生長(zhǎng)；番茄灰霉和2014在提高總皂苷的含量上有顯著作用；2020明顯刺激多糖的合成積累。

2.5.2非生物誘導(dǎo)子Shohael等[30]發(fā)現(xiàn)，不同光源下，刺五加體細(xì)胞胚的不同代謝物含量比暗培養(yǎng)時(shí)增加，部分酶活性提高。紅光下，刺五加皂苷E和E1大量積累，丙二醛、過(guò)氧化氫等的含量及抗氧化酶活性增加；熒光燈下，可以提高總黃銅、總酚類等含量及抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性。

溫度對(duì)五加科植物懸浮培養(yǎng)有一定的影響。熱處理可以提高人參細(xì)胞生長(zhǎng)速率，但培養(yǎng)前期細(xì)胞成活率低。人參不定根皂苷積累最適宜的溫度是25℃；白天20℃、晚上13℃時(shí)有利于不定根生物量的增長(zhǎng)[31]。Shohael等[32]發(fā)現(xiàn)，在低溫(12℃)和高溫(30℃)的反應(yīng)器中，會(huì)抑制刺五加體細(xì)胞胚的生長(zhǎng)，石碳酸、類黃酮等含量也會(huì)下降。

水楊酸對(duì)人參發(fā)根的生長(zhǎng)和總皂苷的積累均無(wú)明顯的促進(jìn)作用，且隨其濃度的增高反而出現(xiàn)抑制作用，即使水楊酸濃度為0.1mmol/L時(shí)，總皂苷產(chǎn)量也僅達(dá)到0.1008g/L；較低濃度的茉莉酸甲酯促進(jìn)總皂苷的積累和人參發(fā)根的生長(zhǎng)；適當(dāng)濃度的水楊酸和茉莉酸甲酯能促進(jìn)Rb1的積累，但效果不明顯[33]。當(dāng)水楊酸的濃度是0.6mg/L時(shí)，西洋參發(fā)狀根達(dá)到生長(zhǎng)量和皂苷含量的最大值；茉莉酸甲酯對(duì)皂苷合成及折干率有較明顯影響[34]。寡糖素可以促進(jìn)人參、西洋參、三七等的懸浮物的生長(zhǎng)和皂苷積累，特別是西洋參里Rg組皂苷。

皂苷類活性物質(zhì)的合成也受前體的作用，特別是作用于其合成途徑的前體。張美萍[11]實(shí)驗(yàn)了甲羥戊酸、L-亮氨酸、醋酸鎂和輔酶A4種前體對(duì)西洋參芽胞愈傷懸浮培養(yǎng)的影響發(fā)現(xiàn)，除甲羥戊酸外，其它前體物都能促進(jìn)生長(zhǎng)，一定濃度的ATP對(duì)西洋參懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和皂苷合成有促進(jìn)作用。

3 反應(yīng)器培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)增殖速度快、培養(yǎng)物同步化、培養(yǎng)量大的特點(diǎn)為植物細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行的生物反應(yīng)器培養(yǎng)提供了條件，而植物反應(yīng)器培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的前提。日本實(shí)現(xiàn)了人參細(xì)胞的工業(yè)化生產(chǎn)，這是五加科植物最早進(jìn)行的反應(yīng)器培養(yǎng)。

80年代，周立剛、鄭光植等先后對(duì)人參、西洋參、三七用機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐進(jìn)行了大量培養(yǎng)，pH 5.8左右時(shí)，利于細(xì)胞生長(zhǎng)和皂苷積累。Woragidbumrung、Hu[35，36]進(jìn)行了三七的反應(yīng)器培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，改良的MS培養(yǎng)基可提高細(xì)胞生長(zhǎng)率、細(xì)胞產(chǎn)量及皂苷和多糖含量；人參寡糖素可使三七的發(fā)酵培養(yǎng)提前進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、指數(shù)生長(zhǎng)期，并明顯作用于該時(shí)期和促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)率增加。

在空氣提升和旋轉(zhuǎn)式的生物反應(yīng)器中，食用土當(dāng)歸(AraliacordataThunb.)體細(xì)胞胚的懸浮培養(yǎng)的增值率最高；在500L的發(fā)酵罐中，懸浮培養(yǎng)食用土當(dāng)歸的細(xì)胞含量增加數(shù)十倍，并可獲得55倍的花青素[37，38]。在鼓泡塔反應(yīng)器中，懸浮培養(yǎng)刺五加胚性愈傷組織成功轉(zhuǎn)化生成植株，轉(zhuǎn)化率達(dá)64.7%[39]。

自王沖之等最先建立了西洋參發(fā)根系統(tǒng)培養(yǎng)后，研究發(fā)現(xiàn)，SJ-1和B5培養(yǎng)基可以促進(jìn)發(fā)根生長(zhǎng)，水解乳蛋白和激素IAA、IBA等利于毛狀根的增殖，水解乳蛋白還能增加皂苷含量。低溫可增強(qiáng)刺五加體細(xì)胞胚的耐低溫性和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[40]；30%～40%的通氧量促進(jìn)人參不定根的增殖[41]。

4 展望

近年來(lái)，五加科藥用植物的懸浮培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)取得了飛速的發(fā)展，對(duì)影響其懸浮培養(yǎng)的因素的研究已比較系統(tǒng)，部分藥用植物的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的研究也有了很大進(jìn)展。作為擁有較多五加科藥用植物的國(guó)家，我國(guó)在該科植物懸浮培養(yǎng)方面雖有了一些成果，但仍需進(jìn)一步地深入研究：通過(guò)物理和化學(xué)的培養(yǎng)因子各自或相互作用，提高懸浮培養(yǎng)物的生物量及活性成分含量，為其他研究獲取更多實(shí)驗(yàn)材料；與其他技術(shù)相結(jié)合，例如分子生物、基因工程、輻射、生物轉(zhuǎn)化等來(lái)建立高產(chǎn)無(wú)性系，得到優(yōu)質(zhì)的品系，豐富五加科藥用植物資源；反應(yīng)器培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)五加科植物懸浮培養(yǎng)的工業(yè)化的關(guān)鍵，篩選反應(yīng)器、優(yōu)化培養(yǎng)條件等建立優(yōu)質(zhì)的懸浮培養(yǎng)體系，獲得更多的五加科植物活性成分。

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