貝母素甲、貝母素乙對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞炎性微環(huán)境的干預(yù)調(diào)節(jié)作用?

張玉人，林洪生，張 英

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

乳腺癌系女性最常見的惡性腫瘤，在歐美國(guó)家乳腺癌約占女性新發(fā)惡性腫瘤的29%，而死亡率約占14%～15%[1]，其轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。而腫瘤的形成、侵襲性及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移行為，與癌細(xì)胞、炎性細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)、成纖維細(xì)胞、免疫抑制細(xì)胞等構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)與炎癥密切相關(guān)，是介導(dǎo)促炎細(xì)胞如Th17、Th9等分化的關(guān)鍵因子之一[2]；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)與炎癥具有一定相輔相成關(guān)系[3]，二者在腫瘤微環(huán)境下相互調(diào)節(jié)；基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9, MMP-9)是重要的炎癥介質(zhì)，可促腫瘤細(xì)胞侵襲并與血管生成密切相關(guān)[4]；而單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)是β亞家族代表，可趨化單核細(xì)胞。

浙貝母(Fritillaria thunbergii Miq.)為百合科貝母屬植物干燥鱗莖，藥性苦寒，具有清熱化痰、解毒散結(jié)及抗炎功效。浙貝母堿(verticine)包括貝母素甲(Peimine)及貝母素乙(Peiminine)為其主要成分。由于4T1細(xì)胞為鼠源炎性乳腺癌細(xì)胞系，故以該細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象擬研究貝母素甲及貝母素乙對(duì)乳腺癌細(xì)胞炎癥相關(guān)腫瘤微環(huán)境的干預(yù)調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所。

1.1.2 主要試劑及藥品 RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；Cell Counting Kit-8試劑盒購(gòu)于建成公司；含血清培養(yǎng)基(serum-supplemented medium, SSM)為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基； ELISA-TGFβ、VEGF、MMP-9、CBA-MCP-1試劑盒均購(gòu)自R&D公司。Trizol、Reverse Transcribe High Capacity RNA-to-cDNA Kit、Gene Expression Master Mix、TGF-β1(Mm01178820_m1)、 VEGF(Mm01281449_m1)、MMP-9(Mm00442991_m1)、GAPDH (Mm99999915_g1)試劑盒及Taqman定制探針均購(gòu)自life technologies公司。

貝母素甲、貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品檢驗(yàn)所)、順鉑注射液(云南個(gè)舊生物制藥有限公司)。

1.1.3 主要儀器 實(shí)驗(yàn)所需主要儀器包括5% CO237℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo公司)、Applied Biosystems Real-Time PCR 7500 System(ABI公司)、酶標(biāo)儀(synergy HT, Biotek公司)、倒置顯微鏡(Nikon TE2000-U)。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備 將20 mg貝母素甲、乙標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇溶劑，總濃度5 mg/ml；順鉑200 mg溶于0.9%NaCl溶液，總濃度0.3 mg/ml。

1.2.2 乳腺癌4T1細(xì)胞株培養(yǎng) 復(fù)蘇4T1細(xì)胞株，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置5% CO237℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.3 Cell Counting Kit-8 檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞將濃度調(diào)整為2×104/ml接種于96孔板，每孔100 μl置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 24 h后棄去培養(yǎng)液，分別加入含貝母素甲、貝母素乙藥品溶液及順鉑培養(yǎng)基200 μl/孔，貝母素甲、乙梯度濃度分別為5 μM/L、10 μM/L、20 μM/L、50 μM/L、60 μM/L、80 μM/L、100 μM/L；順鉑梯度濃度為0.1 μM/L、0.3 μM/L、1 μM/L、3 μM/L、10 μM/L、30 μM/L、100 μM/L；陰性對(duì)照組加入200 μl培養(yǎng)基，空白對(duì)照組不含細(xì)胞，各濃度均設(shè)6復(fù)孔。于加藥后24 h、48 h、72 h分別加入CCK-8試劑，每孔10 μl，2 h后以酶標(biāo)儀檢測(cè)記錄450 nm及630 nm吸光度值(A)，計(jì)算細(xì)胞不同時(shí)間、不同藥物濃度的抑制率。抑制率(%)=[(陰性對(duì)照組A-空白對(duì)照組A)-(實(shí)驗(yàn)組A-空白對(duì)照組A)]/(陰性對(duì)照組A-空白對(duì)照組A)×100%。

1.2.4 炎性微環(huán)境相關(guān)因子水平檢測(cè) 炎性微環(huán)境相關(guān)炎性因子及蛋白的含量主要通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)進(jìn)行檢測(cè)。具體指標(biāo)為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、金屬基質(zhì)蛋白酶9(MMP-9)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)共4項(xiàng)指標(biāo)。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4T1細(xì)胞接種于6孔板，設(shè)置貝母素甲、乙、順鉑及陰性對(duì)照組，以貝母素甲、乙及順鉑IC50(24 h)劑量干預(yù)4T1細(xì)胞24 h后提取上清，各組樣本設(shè)置3復(fù)孔，使標(biāo)準(zhǔn)品及樣本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物，洗滌后每孔加入100 μl 酶標(biāo)抗體，孵育2 h使固相免疫復(fù)合物上抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合，避光加入100 μl酶催化底物，孵育30 min以100 μl 酸性酶反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，根據(jù)顏色反應(yīng)程度進(jìn)行檢測(cè)指標(biāo)的定性及定量。酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值A(chǔ)(檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，矯正波長(zhǎng)為570 nm)，將檢測(cè)結(jié)果在EXCEL軟件中轉(zhuǎn)化為濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)法檢測(cè) 將細(xì)胞接種于6孔板1×105個(gè)/孔，根據(jù)兩步法Trizol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA，將cDNA為模板使用熒光探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增，包括TGF-β1 (Mm01178820_m1)、VEGF (Mm01281449_m1)及MMP-9(Mm00442991_m1)，GAPDH(Mm99999915_g1)為內(nèi)參基因，依據(jù)RT-PCR反應(yīng)曲線閾值循環(huán)數(shù)(ct)及RQ值相對(duì)定量，計(jì)算公式為：2-△△ct。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Cell Counting Kit-8檢測(cè)結(jié)果

圖1顯示，5 μM/L、10 μM/L、20 μM/L、50 μM/L、60 μM/L、80 μM/L及100 μM/L貝母素甲、貝母素乙及順鉑干預(yù)4T1細(xì)胞24 h、48 h、72 h時(shí)抑制率，其中48 h貝母素甲、乙及順鉑IC50濃度分別為14.7 μM/L、 29 μM/L及 13 μM/L。

2.2 ELISA法各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

表1顯示，TGF-β、VEGF、MMP-9及MCP-1檢測(cè)結(jié)果如表1所示。無藥物干預(yù)對(duì)照組4T1乳腺癌細(xì)胞對(duì)炎癥相關(guān)因子TGF-β、VEGF、MMP-9及MCP-1分泌量較高，貝母素甲組TGF-β、VEGF及MCP-1分泌量顯著降低(P<0.05,P<0.01)；貝母素乙組TGF-β, MMP-9及MCP-1分泌量比較對(duì)照組顯著降低(P<0.05,P<0.01)；順鉑組各指標(biāo)均顯著下降(P<0.01)。

2.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖1注：A. 各濃度貝母素甲24 h、48 h、72 h對(duì)4T1細(xì)胞抑制率；B. 各濃度貝母素乙24 h、48 h、72 h對(duì)4T1細(xì)胞抑制率；C. 各濃度順鉑24 h、48 h、72 h對(duì)4T1細(xì)胞抑制率

炎癥相關(guān)因子對(duì)照組貝母素甲貝母素乙順鉑TGF-β0.621±0.0110.424±0.024**0.321±0.01**0.248±0.015**VEGF0.177±0.0030.158±0.008*0.202±0.010.015±0.003**MMP-97.108±0.4415.975±1.6015.615±0.067*5.048±0.013**MCP-10.326±0.0090.193±0.004**△△0.154±0.004**△△0.371±0.001**

注：與對(duì)照組比較:*P<0.05,**P<0.01； 與順鉑組比較:△P<0.05,△△P<0.01

表2 各組細(xì)胞中TGF-β、VEGF、MMP-9的mRNA相對(duì)表達(dá)量

注：與對(duì)照組比較:*P<0.05,**P<0.01； 與順鉑組比較:△P<0.05,△△P<0.01

3 討論

惡性腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移與其炎性相關(guān)腫瘤微環(huán)境存在密切聯(lián)系，近年來已成為研究熱點(diǎn)。4T1細(xì)胞為高轉(zhuǎn)移、三陰性乳腺癌細(xì)胞系，可分泌多種炎性相關(guān)因子，故本研究以4T1細(xì)胞為觀察對(duì)象，探索中藥單體貝母素甲和貝母素乙對(duì)4T1細(xì)胞及其相關(guān)炎性微環(huán)境的調(diào)控作用。

經(jīng)研究顯示，TGF-β是介導(dǎo)炎癥強(qiáng)有力的趨化因子[5]，參與誘導(dǎo)Th17分化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)；而炎癥與血管生成密切相關(guān)[6]，血管生成調(diào)節(jié)因子在各種炎癥狀態(tài)及促腫瘤生成和轉(zhuǎn)移過程中均發(fā)揮著重要作用，其中VEGF不僅能夠促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)異常血管生成[7]，且可抑制細(xì)胞凋亡，增加血管通透性，促腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移；金屬基質(zhì)蛋白酶家族尤其是MMP-9作為炎癥介質(zhì)也參與了血管異常生成和細(xì)胞外基質(zhì)降解，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移。這些炎癥相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)乳腺癌的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

中藥浙貝母具有清熱解毒散結(jié)及抗炎功效，在乳腺癌的臨床治療中廣泛應(yīng)用，而貝母素甲、乙均為浙貝母堿主要成分之一。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，貝母素甲及貝母素乙對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞具有顯著抑制作用，并可有效降低炎性相關(guān)因子分泌及其 mRNA相對(duì)表達(dá)量，發(fā)揮抑炎功效?？梢哉J(rèn)為，中藥單體貝母素甲、乙作為浙貝母有效成分，能夠?qū)θ橄侔┘?xì)胞炎性微環(huán)境起到調(diào)控作用。此外，通過本次研究進(jìn)一步挖掘了浙貝母的抗腫瘤功效，并對(duì)其藥物有效成分的開發(fā)和利用提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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