葛根素對心肌細胞氧化應激損傷的保護作用?

李 寧，郝志梅，崔書霞，熊瑞媛，李繼安，馬宇杰，田 煒，徐菁蔓,6△

(1. 河北聯(lián)合大學醫(yī)學實驗研究中心心臟研究所，河北 唐山 063000；2. 河北聯(lián)合大學管理學院，河北 唐山 063000；3. 解放軍285醫(yī)院，河北 邯鄲 056000；4. 河北聯(lián)合大學中醫(yī)學院，河北 唐山 063000；5. 河北聯(lián)合大學附屬開灤醫(yī)院ICU，河北 唐山 063000；6. 天津醫(yī)科大學生理學與病理生理學系，天津 300070)

氧化應激損傷是引起心臟缺血/再灌注損傷的三大機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyl inositol-3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(v-akt-murinet hymoma viral onco- gene homolog, Akt)信號途徑通過使糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthesis kinase-3, GSK-3β)的Ser9位點磷酸化失活，進而抑制線粒體通透性轉移孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)的開放而減少心肌細胞凋亡和壞死，減輕氧化應激誘發(fā)的心肌細胞損傷[1]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，葛根素(puerarin，Pue)憑借其抑制炎性介質(zhì)產(chǎn)生和釋放、改善微循環(huán)、抗氧化應激、抗細胞凋亡、抑制鈣超載以及改善內(nèi)皮功能等作用在多種心臟疾患的防治過程中發(fā)揮一定的作用[2, 3]。然而，有關Pue心肌保護作用細胞內(nèi)信號傳導機制研究的報道仍較少。本研究利用體外培養(yǎng)心肌H9c2細胞株，從細胞水平探討GSK-3β、PI3K/Akt等細胞內(nèi)信號因子是否參與Pue抗心肌細胞氧化應激損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品

葛根素由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 細胞

大鼠胚胎心臟組織來源的H9c2細胞株，購自于美國ATCC公司。

1.3 試劑及主要儀器

H2O2購自美國 Sigma 公司；TMRE熒光染料購自美國Invitrogen公司；渥曼青霉素(wortmannin, Wort)和MTT細胞增殖及毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所； p-Akt(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)多克隆抗體均購自美國cell signaling公司；GAPDH抗體為中杉金橋生物有限公司產(chǎn)品；37℃二氧化碳孵箱、超低溫冰箱為Thermo Forma 公司產(chǎn)品；FV1000激光共聚焦顯微鏡為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；JY200C電泳儀、半干轉運系統(tǒng)、酶標儀均為BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.4 細胞培養(yǎng)

用10 ml含10%FBS的完全DMEM培養(yǎng)基重懸H9c2細胞并轉入50 ml培養(yǎng)瓶中，放置37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁達培養(yǎng)瓶底壁面積90%以上時進行傳代。將消化下來的細胞離心重懸后分別取2 ml細胞懸液接種于共聚焦或蛋白提取專用培養(yǎng)皿中，于實驗前倒掉培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次后換2 ml臺氏液(單位mM: NaCl 140, KCl 6, MgCl21, CaCl21, HEPES 5, 葡萄糖 5.8)于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。

1.5 實驗分組

將培養(yǎng)的H9c2細胞分為4組：①空白對照組；②H2O2組，加入650 μMH2O2處理細胞20 min；③Pue+H2O2組，在H2O2(650 μM)處理之前分別加入Pue(0.001～1 μM)處理20 min；④Wort+Pue+H2O2組，Pue和H2O2處理時間同前，于加入Pue之前加入Wort(1 μM)處理10 min；⑤Wort+ H2O2組，加入Wort(1 μM)處理10 min后加入H2O2處理細胞20 min。

1.6 測定線粒體膜電位

在應激條件下mPTP大量開放，分子量小于1.5 kD的物質(zhì)，如H+和水可以自由地通過線粒體膜，導致線粒體腫脹、線粒體膜電位消失、外膜破壞，進而引起細胞凋亡和壞死。因此，很多研究利用線粒體膜電位的改變作為mPTP開放狀態(tài)的指針[4, 5]。TMRE是1種可自由通過細胞膜無毒性的熒光染料，通過測定TMRE熒光強度的改變確定線粒體膜電位的變化。實驗前，將TMRE(100 nM)加入到共聚焦專用培養(yǎng)皿中孵育20 min，用波長543 nM的氦氖激光激發(fā)熒光染料TMRE呈現(xiàn)紅色熒光，掃描記錄加入H2O2處理0 min和20 min圖像，對其熒光值進行分析。

1.7 MTT法檢測細胞增殖

選取對數(shù)生長期的細胞進行細胞計數(shù)，使得96孔板每孔加入100 μL約2000個細胞。按照實驗分組處理細胞，每孔重新?lián)Q培養(yǎng)基100 μL后加入10 μLMTT溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。隨后每孔再加入100 μLFormanzan溶解液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育15 min左右，直至在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formanzan全部溶解后，用酶標儀測定570 nM波長處的吸光度(OD值)。細胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.8 Western blotting

棄去培養(yǎng)皿內(nèi)液體，用冷PBS沖洗3次，每個皿內(nèi)加入含有PMSF的蛋白裂解液50 μL，放置在冰上裂解40 min。將收集細胞于4℃ 12000 r/min條件下離心5 min取上清，用BCA法測定蛋白質(zhì)含量，每個泳道蛋白上樣量20 μg，用10%～12%的 SDS- PAGE分離蛋白質(zhì)，PVDF膜轉膜、封閉，將膜放入一抗中4℃過夜，TBST沖洗3次，將膜加入相應二抗中室溫孵育2 h，TBST沖洗后用ECL顯色，掃描后用ImageJ圖像分析軟件對圖像進行分析。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 不同濃度葛根素對心肌細胞mPTP影響

表1圖1顯示，H2O2(650 μM)處理H9c2細胞20 min后，TMRE熒光強度明顯降低(P<0. 05)，提示氧化應激能夠增加mPTP開放引起H9c2細胞線粒體損傷。與H2O2組比較， Pue(0.001～1 μM)+H2O2組TMRE熒光減弱程度明顯減輕(P<0.05)，提示Pue可以抑制mPTP開放，減輕氧化應激所引起的心肌細胞線粒體損傷。

表1 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位

注：與正常對照組比較：*P<0.05

圖1 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位H2O2處理0 min和20 min,圖中淺色為TMRE熒光

2.2 葛根素對細胞活性的影響

表2顯示，MTT法對細胞活性檢測結果顯示，與H2O2(650 μM)處理組比較，Pue(0.1 μM)預處理組細胞生存率明顯提高(P<0.05)，表明Pue能夠減輕氧化應激造成的心肌細胞損傷。

2.3 葛根素對 GSK-3β 磷酸化的影響

表3圖2顯示，Western blotting 結果顯示與空白對照組比較，H2O2(650 μM)處理組p-GSK-3β(Ser9)表達明顯降低(P<0.05)，提示H2O2通過抑制GSK-3β的磷酸化失活，進而引起心肌細胞損傷。然而，Pue(0.1 μM)能夠明顯增加p-GSK-3β(Ser9)的表達水平(P<0.05)，表明Pue通過增加GSK-3β的磷酸化失活抑制mPTP開放，進而減輕氧化應激引起的心肌細胞線粒體損傷。

表2 葛根素對細胞活性的影響

注：與正常對照組比較：*P<0.05;與H2O2組比較：#P<0.05

表3 Westem blotting檢測p-GSK-3β(Ser9)和p-Akt(Ser473)蛋白的表達

注：與正常對照組比較：*P<0.05;與H2O2組比較：#P<0.05

圖2 Western blotting檢測p-GSK-3β(Ser9)和p-Akt(Ser473蛋白的表達

2.4 葛根素對 Akt 磷酸化的影響

表3圖2顯示，與空白對照組比較，Pue(0.1 μM)未能使p-Akt(Ser473)表達增加；與 H2O2組比較，加入Pue(0.1 μM)預處理后p-Akt(Ser473)的表達水平也沒有明顯改變，說明Akt并沒有在Pue抗心肌氧化應激損傷的保護作用中發(fā)揮作用。

2.5 PI3K抑制劑Wort對葛根素抗心肌氧化應激損傷作用的影響

表1所示，與Pue+ H2O2組比較，Wort+Pue+H2O2組的TMRE熒光強度改變不明顯，也提示PI3K/Akt信號通路并未參與Pue的抗心肌氧化應激損傷作用。

3 討論

Pue是從豆科植物葛根中提取的一種異黃酮化合物，是葛根的主要活性成分。最初由于其能夠增強胰島素受體敏感性，減輕2型糖尿病患者的胰島素抵抗進而引起廣泛關注[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Pue能夠減輕糖尿病大鼠的心肌氧化應激損傷以及心肌細胞凋亡[6, 7]。本研究中MTT結果顯示，Pue對氧化應激誘發(fā)的心肌H9c2細胞損傷具有保護作用。同時，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位發(fā)現(xiàn)，與H2O2處理組比較，Pue預處理后心肌細胞線粒體膜電位減弱程度明顯減輕，進一步說明Pue通過抑制mPTP的開放而減輕氧化應激造成的心肌細胞線粒體損傷。

糖原合成酶激酶-3(glycogen synthesis kinase-3, GSK-3)有2種形式，GSK-3α(51 kDa)和 GSK-3β(47 kDa)，其中GSK-3β是一種普遍存在于真核生物中的多功能絲/蘇氨酸(serine/threonine, Ser/Thr)類激酶，其通過使底物蛋白磷酸化來調(diào)節(jié)糖原的合成代謝，參與細胞的分化、增殖、黏附及細胞凋亡等一系列過程[8]。GSK-3β被認為是調(diào)控心肌細胞mPTP開放的關鍵因子之一，嗎啡[4]、腺苷[9]、白藜蘆醇[10]等很多藥物都能夠通過抑制GSK-3β的活性來阻止mPTP開放，從而發(fā)揮心肌保護作用。本研究結果顯示，Pue預處理能夠顯著增加GSK-3β(Ser9)磷酸化，提示它也可以通過使GSK-3β失活阻止mPTP開放，減輕氧化應激誘發(fā)的心肌細胞損傷。

PI3K/Akt信號通路在缺血預處理和缺血后處理誘發(fā)的心臟保護中發(fā)揮著關鍵作用，同時PI3K/Akt信號通路被認為是調(diào)節(jié)GSK-3β活性的關鍵信號通路之一[11]。然而本實驗結果顯示，PI3K/Akt信號通路并未在Pue抗心肌細胞氧化應激損傷的保護作用中發(fā)揮作用。

綜上所述，Pue通過使GSK-3β失活抑制mPTP

的開放，從而減輕氧化應激誘發(fā)的心肌細胞損傷，而PI3K/Akt信號傳導通路并未參與此過程。

[1] Nishihara M, Miura T, Miki T, et al. Modulation of the mitochondrial permeability transition pore complex in GSK-3β-mediated myocardial protection[J]. J Mol Cell Cardiol, 2007, 43(5): 564-570.

[2] 韓春妍. 葛根素治療相關疾病的研究[J].實用藥物與臨床, 2012, 15(3): 178-180.

[3] 陳秀芳, 雷康福, 董敏, 等. 葛根素對糖尿病大鼠心肌損傷的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(4): 650-655.

[4] Xi J, Tian W, Zhang L, et al. Morphine prevents the mitochondrial permeability transition pore opening through NO/cGMP/PKG/Zn2+/GSK-3beta signal pathway in cardiomyocytes[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2010, 298(2): 601-607.

[5] Xi J, Wang H, Mueller RA, et al. Mechanism for resveratrol-induced cardioprotection against reperfusion injury involves glycogen synthase kinase 3beta and mitochondrial permeability transition pore[J]. Eur J Pharmacol, 2009, 604(1-3):111-116.

[6] 陳秀芳, 雷康福, 董敏, 等.葛根素對糖尿病大鼠心肌損傷的影響[J].中國病理生理雜志, 2010, 26(4):650-655.

[7] 張玲, 龐莉, 高俊虹, 等.葛根素對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡及相關蛋白表達的影響[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志, 2011, 17(3):323-325.

[8] Cohen P, Frame S. The renaissance of GSK3[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001, 2: 769-776.

[9] Xi J, McIntosh R, Shen X, et al. Adenosine A2A and A2B receptors work in concert to induce a strong protection against reperfusion injury in rat hearts[J]. J Mol Cell Cardiol, 2009, 47(5):684-90.

[10] Xi J, Wang H, Mueller RA, et al. Mechanism for induced cardioprotection against reperfusion injury involves glycogen synthase kinase 3beta and mitochondrial permeability transition pore[J]. Eur J Pharmacol, 2009, 604(1-3):111-116.

[11] Bodine SC. mTOR signaling and the molecular adaptation to resistance exercise[J]. Med Sci Sports Exerc, 2006, 38(11):1950-1957.