鴨疫里氏桿菌的分離鑒定和藥敏試驗

劉麗君萬培偉萬根劉昌林

（1.吉安市澄江鎮(zhèn)人民政府，江西 吉安 343000；2.江西生物科技職業(yè)學院；3.江西農(nóng)業(yè)大學；4.南昌市農(nóng)科院）

鴨疫里氏桿菌的分離鑒定和藥敏試驗

劉麗君1萬培偉2萬根3劉昌林4

（1.吉安市澄江鎮(zhèn)人民政府，江西 吉安 343000；2.江西生物科技職業(yè)學院；3.江西農(nóng)業(yè)大學；4.南昌市農(nóng)科院）

對江西豐城地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)鴨場疑似鴨傳染性漿膜炎的病死鴨進行病原菌的分離鑒定、生化試驗和藥敏試驗,初步鑒定為鴨疫里氏桿菌。藥敏實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌對慶大霉素、鏈霉素、氯霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、呋喃唑酮高度敏感，對青霉素、紅霉素、諾氟沙星、四環(huán)素、氨芐西林存在耐藥性。

鴨疫里氏桿菌；生化鑒定；藥敏試驗

鴨疫里氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎[1]，是由鴨疫里氏桿菌(Riemerellaanatipestifer,RA)引起的以家鴨、家鵝、火雞等多種禽類多發(fā)的一種急性或慢性傳染病，主要引起1～8周齡尤其是2～3周齡雛鴨大批發(fā)病、死亡、生長發(fā)育受阻[2]，其病理變化特點為纖維性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪型輸卵管炎和腦膜炎，發(fā)病率5%～90%，病死率可高達90%[3]，隨著抗藥菌廣泛、長期大量甚至違規(guī)使用，使得鴨疫里氏桿菌耐藥現(xiàn)象日益增多，因此用藥前最好能做藥敏實驗，篩選高敏藥物，并注意藥物的交替使用。目前鴨傳染性漿膜炎已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要細菌性傳染病之一,通過細菌分離、鑒定、生化鑒定、藥敏實驗，對于鴨疫里氏桿菌的預(yù)防和治療有一定的意義。

本研究從初步鑒定為鴨疫里氏桿菌病的病死鴨心包液、肝臟、和脾臟等病料中分別進行了細菌的分離和鑒定，并進行了藥敏試驗確定了其敏感藥，為鴨傳染性漿膜炎的有效防制提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源。從江西省豐城地區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)鴨場疑似鴨傳染性漿膜炎發(fā)病鴨中取鴨的心臟、肝臟與平皿內(nèi)，4℃保存待檢。

1.1.2 主要試劑。藥敏片和生化微量發(fā)酵管（購自杭州天和微生物試劑有限公司，4℃冰箱保存）、無菌犢牛血清（購自杭州天杭微生物科技有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基。胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（自制）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（自制）。

1.2 實驗方法

1.2.1 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基的制備。酪蛋白胰酶消化物15g、大豆粉木瓜蛋白酶消化物5g、氯化鈉5g、瓊脂15g、純化水1000mL，取各成分加熱溶解，并調(diào)pH值至7.3±0.2，115℃高壓滅菌20min。倒入平板、冷卻備用。

1.2.2 細菌的分離與培養(yǎng)。無菌取死鴨的心血、肝臟、腦、脾臟等病料并分別劃線接種到胰蛋白胨大豆瓊脂含有血清的平板、麥康凱瓊脂平板2種培養(yǎng)基各2份，一份37℃常規(guī)培養(yǎng)24～48h,另一份置入CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24～48h[5]。觀察細菌的生長情況、菌落特征，并取生長良好的疑似菌落進行純化。

1.2.3 細菌形態(tài)的觀察與革蘭氏染色步驟。將純化培養(yǎng)的菌落進行涂片，進行革蘭氏染色：滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，染1～3min，水洗；加革蘭氏碘液媒染，作用1～2min，水洗；加95%酒精脫色約30s至1 min，水洗；加沙黃水溶液復(fù)染30s左右，水洗，染色后，在油鏡下觀察細菌形態(tài)。

1.2.4 生化特征鑒定。選擇甘露酣、醋酸鹽、枸櫞酸鹽、H2S、山梨醇、甘露醇、山梨醇、乳糖、木糖、棉子糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、尿素、還原性硝酸鹽等微量生化反應(yīng)管進行試驗。用無菌生理鹽水將分離菌純培養(yǎng)物洗下并制成懸液,分別接種于各微量生化反應(yīng)管，37℃放置48h，觀察結(jié)果。

1.2.5 藥敏試驗。按常規(guī)藥敏片法測定分離菌株對青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、慶大霉素、鏈霉素、呋喃唑酮等13種抗菌素的敏感性。判定標準：抑菌直徑

小于10mm為不敏感，10～14mm為中敏，15～20mm高敏，大于20mm為極敏。藥敏試驗按常規(guī)K－B法進行[6]，判斷標準參照CLSIM100－S20[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離及培養(yǎng)特性結(jié)果

經(jīng)24h培養(yǎng)后觀察麥康凱培養(yǎng)基上不見細菌生長，在CO2培養(yǎng)箱的胰蛋白胨大豆瓊脂固體培養(yǎng)基可見到表面光滑、稍隆起、圓形、邊緣整齊、有光澤、直徑大小為1～1.8mm的菌落，其分離培養(yǎng)特性和鴨疫里氏桿菌的特性一致。

2.2 染色的形態(tài)特征

革蘭氏染色后，在油鏡下可見分離的陰性短桿菌，菌體呈多形性（菌體長短不一，部分菌體呈長絲狀）多數(shù)呈單個存在，少數(shù)成雙排列,沒有芽孢,不能運動。其形態(tài)特征和鴨疫里氏桿菌的形態(tài)一致。

2.3 生化鑒定結(jié)果

表1 分離菌的生化鑒定結(jié)果

分離菌只與尿素反應(yīng)呈陽性，其它反應(yīng)均為陰性，生化鑒定結(jié)果與鴨疫里氏桿菌的生化特性基本一致。根據(jù)細菌的分離培養(yǎng)實驗、其形態(tài)觀察及生化結(jié)果，將該菌鑒定為鴨疫里氏桿菌。2.4藥敏試驗結(jié)果

分離菌對慶大霉素、鏈霉素、氯霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、呋喃唑酮為高度敏感，對青霉素、紅霉素、四環(huán)素、氨芐西林、諾氟沙星有耐藥性。（表2）

表2 分離菌的藥敏試驗結(jié)果mm

3 討論

本試驗收集了江西豐城地區(qū)鴨場的病例，其臨床癥狀和病理變化符合鴨疫里氏桿菌病的特征，部分分離到了病原菌，根據(jù)臨床癥狀、病理變化、細菌形態(tài)特性及生化特征等鑒定，確診為鴨疫里氏桿菌。

對鴨疫里氏桿菌的研究表明鴨疫里氏桿菌容易產(chǎn)生耐藥性，由于大量使用和濫用抗生素，鴨疫里氏桿菌對許多抗生素藥物都有不同程度的耐藥性。而且各地菌株之間耐藥譜不盡相同，呈現(xiàn)多樣化[8]。

本試驗通過藥敏試驗結(jié)果表明，該菌株對慶霉素、鏈霉素、氯霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、呋喃唑酮為高度敏感。所以該場對于鴨疫里氏桿菌的藥物防治可以選擇以上藥物。對青霉素、紅霉素、諾氟沙星、四環(huán)素、氨芐西林有耐藥性，產(chǎn)生耐藥性原因可能是養(yǎng)殖者盲目在飼料或飲水中長期添加大量的抗菌藥，因此建議發(fā)生細菌性疾病時，首先應(yīng)從改善環(huán)境衛(wèi)生和加強飼養(yǎng)管理入手，不要盲目添加抗生素類藥物，同時可結(jié)合維生素、中草藥進行治療。因此用藥前最好做藥敏試驗，篩選高敏藥物，并注意藥物的交替使用以避免其耐藥性的產(chǎn)生。

疫苗防控也是防治該病的有效方法之一，注射疫苗可使機體產(chǎn)生有效保護[9、10]，但由于該病的血清型較多，不同血清型間交叉保護率低，因此，疫苗的選擇必須與本地流行血清型相吻合[11]，選擇優(yōu)勢血清型制備疫苗進行預(yù)防。

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