脯氨酸-4-羥化酶在大腸桿菌中的密碼子優(yōu)化表達(dá)及對(duì)反式-4-羥脯氨酸生物合成的作用

劉合棟，袁春偉，張震宇

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫214122)

脯氨酸-4-羥化酶在大腸桿菌中的密碼子優(yōu)化表達(dá)及對(duì)反式-4-羥脯氨酸生物合成的作用

劉合棟，袁春偉，張震宇

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫214122)

為了使脯氨酸-4-羥化酶基因在重組大腸桿菌中得到高表達(dá)，通過調(diào)整大腸桿菌密碼子偏好性以及mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，使得脯氨酸-4-羥化酶基因得到優(yōu)化。將優(yōu)化后的脯氨酸-4-羥化酶基因插入含有色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子的pUC19質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-ptrp2-Hyp，并導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中。在搖瓶水平，重組菌以L-脯氨酸為底物發(fā)酵8 h,可積累(0.492±0.034) g/L 的反式-4-羥脯氨酸。在發(fā)酵罐水平，通過補(bǔ)料分批發(fā)酵來提高反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量，當(dāng)補(bǔ)糖速率為18 g/h時(shí)，反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量高達(dá)42.5 g/L，反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)率為0.966 g/(L·h)。

重組大腸桿菌；脯氨酸-4-羥化酶；反式-4-羥脯氨酸；密碼子優(yōu)化；發(fā)酵；條件優(yōu)化

反式-4-羥脯氨酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、動(dòng)物飼料和美容業(yè)等方面。在醫(yī)藥方面，反式-4-羥脯氨酸作為原料可用于合成消炎藥、碳青霉烯類[1]。在化工上，反式-4-羥脯氨酸可作為手性原料合成多種聚合物[2]。在動(dòng)物飼料應(yīng)用上，添加反式-4-羥脯氨酸可防止因甘氨酸合成不足而導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)不良現(xiàn)象[3]。反式-4-羥脯氨酸用于高級(jí)化妝品中，可消除氧化劑和調(diào)整細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)[4]。目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的主要方法是生物提取法，利用動(dòng)物蛋白來源，如明膠、豬皮為原料，經(jīng)酸、堿水解后提取反式-4-羥脯氨酸。該方法純化步驟長(zhǎng)，成本高，且廢棄物污染嚴(yán)重[5]；而化學(xué)合成方法合成成本高，也不適合工業(yè)生產(chǎn)[6]。

隨著微生物資源的開發(fā)和生物技術(shù)的發(fā)展，利用微生物生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸成為可能。1961年， Katz等[7]發(fā)現(xiàn)反式-4-羥脯氨酸作為前體物參與鏈霉菌放線菌素的合成，即羥脯氨酸可經(jīng)微生物酶代謝合成。1979年，Katz等[8]研究發(fā)現(xiàn)游離的反式-4-羥脯氨酸參與綠灰菌素的代謝。Shibasaki等[9]通過篩選得到1株脯氨酸-4-羥化酶酶活最高的指孢囊菌，并命名為指孢囊菌RH1，測(cè)序獲得脯氨酸-4-羥化酶基因序列。1997年，Shibasaki等[10]將指孢囊菌RH1脯氨酸-4-羥化酶基因置于一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控下，導(dǎo)入大腸桿菌中，在發(fā)酵罐中發(fā)酵100 h后，反式-4-羥脯氨酸的積累量達(dá)到41 g/L。Shibasaki等[11]將脯氨酸代謝關(guān)鍵酶基因?qū)氲椒词?4-羥脯氨酸生產(chǎn)菌中，在以葡萄糖為底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h后，反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到25 g/L。

為了進(jìn)一步提高脯氨酸4-羥化酶的表達(dá)量和反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量，可利用終止強(qiáng)度更大的終止密碼子TAAT代替常用的終止密碼子TAA或者TAG[12]，改變密碼子偏好性[13]，降低5′端GC百分比[14]，降低mRAN二級(jí)結(jié)構(gòu)，優(yōu)化發(fā)酵條件和補(bǔ)料策略[15]。本文的主要目的是通過優(yōu)化脯氨酸-4-羥化酶基因的表達(dá)以及大腸桿菌發(fā)酵補(bǔ)料策略，促進(jìn)脯氨酸4-羥化酶的表達(dá)和反式-4-羥脯氨酸的積累。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

所有的DNA序列由上海旭冠公司合成。T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司。所用菌株和質(zhì)粒見表1，其中質(zhì)粒pAMP由pUC19質(zhì)粒構(gòu)建而成。

表1 菌株與質(zhì)粒

1.2 脯氨酸-4-羥化酶基因的優(yōu)化

脯氨酸-4-羥化酶基因序列來源于GenBank(登錄號(hào)BAA20094.1)。由于大腸桿菌與脯氨酸-4-羥化酶基因的來源菌指孢囊菌[9]的密碼子偏好性差異較大，為了使脯氨酸-4-羥化酶在大腸桿菌中得到高表達(dá)，首先通過同義轉(zhuǎn)換調(diào)整密碼子偏好性，將脯氨酸-4-羥化酶基因的低使用率密碼子替換為在大腸桿菌中使用頻率高的密碼子，并調(diào)整脯氨酸-4-羥化酶基因的GC百分比，使得最終的脯氨酸-4-羥化酶基因GC百分比接近大腸桿菌GC百分比。為了便于基因克隆和操作，通過同義轉(zhuǎn)化消除脯氨酸-4-羥化酶基因的酶切位點(diǎn)。最后，利用RNAstructure 5.3軟件預(yù)測(cè)脯氨酸-4-羥化酶基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，并計(jì)算出mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能ΔG，并通過調(diào)整脯氨酸-4-羥化酶基因的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，使得脯氨酸-4-羥化酶基因mRNA的5′端避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，最終使脯氨酸-4-羥化酶基因得到優(yōu)化。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

為了高效表達(dá)脯氨酸-4-羥化酶基因，引入強(qiáng)啟動(dòng)子-色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子，色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子(圖1)由色氨酸和色氨酸結(jié)構(gòu)類似物調(diào)控，當(dāng)發(fā)酵液中缺少色氨酸時(shí)，色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子控制脯氨酸-4-羥化酶基因的表達(dá)。

圖1 色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子序列Fig.1 Tryptophan tandem promoter sequence

優(yōu)化后的脯氨酸-4-羥化酶基因和色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子序列由上海旭冠公司合成。為了便于基因操作，在優(yōu)化后的脯氨酸-4-羥化酶基因5′和3′端分別加入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，在色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子基因5′和3′端分別加入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，將合成好的脯氨酸-4-羥化酶基因連接到pAMP質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒PAMP-Hyp；然后將合成后的色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子基因經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，連接到經(jīng)同樣酶雙酶切后的pAMP-Hyp質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAMP-ptrp2-Hyp。將重組質(zhì)粒pAMP-ptrp2-Hyp經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，獲得含有優(yōu)化后的脯氨酸-4-羥化酶基因和色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子基因片段，將該片段連接到pUC19質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pUC19- ptrp2-Hyp的構(gòu)建過程如圖2所示。

圖2 pUC19-ptrp2-Hyp重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of expression vector pUC19-ptrp2-Hyp

1.4 重組大腸桿菌的構(gòu)建

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pUC19- ptrp2-Hyp轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)中，并涂布在相應(yīng)的抗性平板上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，待長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證。

重組大腸桿菌，在脯氨酸-4-羥化酶基因強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，在細(xì)胞內(nèi)將L-脯氨酸和2-酮戊二酸分別轉(zhuǎn)化為反式-4-羥脯氨酸和琥珀酸，其中，2-酮戊二酸由葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)(TCA)途徑代謝獲得。

1.5 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸

重組大腸桿菌經(jīng)稀釋后涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素LB平板中，于37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落，接種到30 mL(250 mL搖瓶)LB培養(yǎng)基中，220 r/min、37 ℃培養(yǎng)8 h后，按6%的接種量接種到30 mL(250 mL搖瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基中，220 r/min、35 ℃培養(yǎng)8 h。發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖10 g/L，甘油5 g/L，胰蛋白胨8 g/L，(NH4)2SO45 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO40.2 g/L，F(xiàn)eSO43 mmol/L，CaCl20.015 g/L，脯氨酸200 mmol/L。

1.6 脯氨酸-4-羥化酶全細(xì)胞活性測(cè)定[9]

發(fā)酵液離心后，稱取濕菌體質(zhì)量，然后用酶反應(yīng)緩沖液將細(xì)胞沖洗懸浮后，在35 ℃搖床中200 r/min培養(yǎng)10 min，然后在沸水中加熱2 min，滅活菌體，終止酶反應(yīng)，測(cè)定反式-4-羥脯氨酸濃度，反式-4-羥脯氨酸測(cè)定采用氯胺T法[16]。

1.7 補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸

將保藏于-80 ℃冰箱的菌種涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，從平板上挑取單菌落，接種至裝有30 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角搖瓶中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)8～8.5 h后，將種子按6%的接種量接種于的7 L BioFlo 415發(fā)酵罐中，裝液量4 L，發(fā)酵溫度35 ℃，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的氨水控制pH為6.5以上，通氣量為1～3 vvm(1個(gè)vvm表示每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值)，攪拌轉(zhuǎn)速為400～900 r/min。在發(fā)酵過程中，通過調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，使得發(fā)酵罐溶氧水平維持在40%以上，以殘?zhí)堑暮谋M為標(biāo)志開始補(bǔ)加質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%葡萄糖，此時(shí)開始采用不同的流加速率開始補(bǔ)料。發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖10 g/L，甘油5 g/L，胰蛋白胨8 g/L，(NH4)2SO45 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO40.2 g/L，F(xiàn)eSO43 mmol/L，CaCl20.015 g/L，L-脯氨酸400 mmol/L。

1.8 菌體濃度和葡萄糖、反式-4-羥脯氨酸的測(cè)定

分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液A600值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合細(xì)胞干質(zhì)量DCW(g/L)和菌液A600值的回歸方程為DCW=0.54A600。發(fā)酵液葡萄糖采用SBA-40 C型生物傳感分析儀測(cè)定(山東省科學(xué)院生物研究所)，反式-4-羥脯氨酸的測(cè)定方法采用氯胺T法[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 脯氨酸-4-羥化酶基因的優(yōu)化設(shè)計(jì)和合成

脯氨酸-4-羥化酶基因序列的密碼子使用頻率分析由數(shù)據(jù)庫(kù)完成(http://www.kazusa.or.jp/codon)，分析結(jié)果顯示：來源于指孢囊菌的初始脯氨酸-4-羥化酶基因部分密碼子在大腸桿菌中的使用頻率很低，如CAC(His)、CUC(Leu)、CGG(Arg)、UCG(Ser)、GUC(Val)，這些密碼子的使用頻率均低于15%，而且，這些低頻密碼子以集群形式分布在脯氨酸-4-羥化酶mRNA上，會(huì)進(jìn)一步影響大腸桿菌蛋白的表達(dá)[17]。同時(shí)，初始脯氨酸-4-羥化酶基因的GC百分比高達(dá)73.62%，遠(yuǎn)高于大腸桿菌基因GC百分比。

具體的優(yōu)化過程如表2所述。第一步，根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性，利用密碼子優(yōu)化軟件JCAT[18]，通過同義轉(zhuǎn)換，將來源于指孢囊菌的脯氨酸-4-羥化酶基因中的低頻密碼子替換為大腸桿菌高表達(dá)基因密碼子，同時(shí)，調(diào)整脯氨酸-4-羥化酶基因的GC百分比，使得4-羥化酶基因的GC百分比接近大腸桿菌，該步驟改變了141個(gè)核苷酸，同時(shí)GC百分比也從73.62%降到了59.46%，更接近大腸桿菌高表達(dá)基因的GC百分比。第二步，為了便于基因工程操作，通過同義轉(zhuǎn)化消除脯氨酸-4-羥化酶基因的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。第三步，利用RNA折疊分析軟件5.3預(yù)測(cè)脯氨酸-4-羥化酶基因的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，mRNA折疊自由能，通過改變同義密碼子調(diào)整mRNA的5′端結(jié)構(gòu)，使得脯氨酸-4-羥化酶基因的mRNA的5′端避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖3所示，優(yōu)化之前的mRNA折疊能ΔG為-1 281.6 kJ/mol，優(yōu)化后的mRNA折疊能ΔG為-1 202.5 kJ/mol，優(yōu)化后的脯氨酸-4-羥化酶基因的mRNA保證AUG起始密碼子后及其后的幾個(gè)堿基組成的密碼子翻譯口袋呈打開狀態(tài)，降低核糖體結(jié)合到mRNA上的能勢(shì)，使得核糖體能夠順利地沿著起始密碼子向后翻譯，最終脯氨酸-4-羥化酶基因序列得到優(yōu)化。由于在優(yōu)化過程中后一優(yōu)化步驟對(duì)前一優(yōu)化步驟的調(diào)整，最終的密碼子數(shù)/核苷酸數(shù)改變并不是前面三步優(yōu)化的累加。

與野生型脯氨酸-4-羥化酶基因序列比較，優(yōu)化后的脯氨酸-4-羥化酶基因共改變了137個(gè)密碼子和139個(gè)核苷酸，同時(shí)，GC百分比從73.62%降低到59.27%，更接近大腸桿菌高表達(dá)基因的GC百分比含量，優(yōu)化后的脯氨酸-4-羥化酶基因如圖4所示。

表2 密碼子優(yōu)化過程

A—調(diào)整之前的序列；B—調(diào)整之后的序列圖3 脯氨酸-4-羥化酶mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Native gene mRNA secondary structure and adjusted gene mRNA secondary structure was predicted by software

圖4 野生型脯氨酸-4-羥化酶基因(上)與優(yōu)化后的脯氨酸-4-羥化酶基因(下)的序列比對(duì)Fig.4 Alignment of nucleotide sequences between wild-type gene(upper) and synthetic optimized (lower), changed base are indicated

2.2 脯氨酸-4-羥化酶在大腸桿菌中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pAMP-ptrp2-Hyp經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，其中較小的條帶為色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子和脯氨酸-4-羥化酶基因序列，雙酶切后最終形成1 850和1 063 bp 2條條帶，如圖5所示。經(jīng)DNA測(cè)序，序列完全正確。

1—pAMP-ptrp2-Hyp雙酶切；2—1 kb ladder marker M1181圖5 pAMP-ptrp2-Hyp雙酶切 Fig.5 Double digestion of pAMP-ptrp2-Hyp

由于pAMP質(zhì)粒上酶切位點(diǎn)少，不便于外源基因的引入，因此最終選擇實(shí)驗(yàn)室常用的質(zhì)粒pUC19作為脯氨酸-4-羥化酶的表達(dá)質(zhì)粒，將優(yōu)化后的脯氨酸-4-羥化酶基因和色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子序列經(jīng)雙酶

切后，連接到pUC19質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-ptrp2-Hyp，然后將重組質(zhì)粒pUC19-ptrp2-Hyp轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建重組菌，經(jīng)搖瓶發(fā)酵，重組菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量和全細(xì)胞酶活如表3所示，重組菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量高達(dá)(0.492±0.034) g/L，同時(shí)，全細(xì)胞活性達(dá)到(0.75±0.08) U/g。

2.3 重組大腸桿菌發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸

搖瓶培養(yǎng)過程中無(wú)法控制pH和溶氧值，而且搖瓶發(fā)酵容易導(dǎo)致供氧不足，很難達(dá)到高密度發(fā)酵。提高反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量和L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化率，必須通過重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵來實(shí)現(xiàn)，因此，研究重組大腸桿菌在發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵中的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酸情況是必經(jīng)之路。反式-4-羥脯氨酸發(fā)酵中，殘余的C源過多會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌代謝副產(chǎn)物增多，乙酸過量積累，最終使得發(fā)酵提前結(jié)束；而當(dāng)C源不足時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度過慢，同樣會(huì)導(dǎo)致4-反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量下降。因此，選擇合適的補(bǔ)料策略至關(guān)重要。勻速流加補(bǔ)料策略廣泛應(yīng)用于各種表達(dá)系統(tǒng)，與其他補(bǔ)料策略相比，勻速流加補(bǔ)料策略操作方便簡(jiǎn)單，易于控制。勻速流加發(fā)酵對(duì)降低底物抑制、提高細(xì)胞生物量和目的產(chǎn)物產(chǎn)量等具有重要的作用。

表3 重組菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量和全細(xì)胞脯氨酸-4-羥化酶活性

注：a—將 1個(gè)單位酶活定義為1 min將1 nmol脯氨酸完全轉(zhuǎn)化為反式-4-羥脯氨酸的酶量，單位為U；脯氨酸-4-羥化酶全細(xì)胞 活性是單位體積發(fā)酵液1 g干細(xì)胞的酶活，單位為U/g。

按照1.7的方法進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，采用連續(xù)補(bǔ)料流加，并考察不同的葡萄糖流加速度對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響，3個(gè)不同的連續(xù)流加速率分別為12、18和24 g/h，發(fā)酵結(jié)果如圖6所示。

圖6 重組大腸桿菌在不同的勻速補(bǔ)糖速率下的菌體濃度、 殘?zhí)呛头词?4-羥脯氨酸產(chǎn)量的變化Fig.6 The cell concentration，glucose concentration and trans-4-hydroxyproline concentration curves of recombinant E.coli in fed-batch cultures by constant rate feeding strategy

由圖6可知：當(dāng)葡萄糖以24 g/h的速率勻速流加時(shí)，殘?zhí)窃?6 h后開始過量積累，20 h時(shí)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度達(dá)到1 g/L，在培養(yǎng)48 h后發(fā)酵結(jié)束，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度高達(dá)5.08 g/L。由于殘?zhí)沁^量積累，可能導(dǎo)致代謝抑制物和乙酸的積累，從而影響反式-4-羥脯氨酸的積累，最終的菌體A600和反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量分別為38.2和27.0 g/L。當(dāng)以12 g/h的速率勻速流加葡萄糖時(shí)，發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛纫恢本S持在0～0.1 g/L之間，直至發(fā)酵結(jié)束，然而，與以24 g/h的速率勻速流加葡萄糖液相比，補(bǔ)糖速率為12 g/h時(shí)的最大細(xì)胞濃度A600只能達(dá)到31.83，而且反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量也明顯降低。由此可知，當(dāng)發(fā)酵液中的殘留葡萄糖一直維持在很低的水平時(shí)(<0.1 g/L)，雖然并未抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，但是葡萄糖是重組大腸桿菌生產(chǎn)必須的C源和能源物質(zhì)，葡萄糖的供給不足，導(dǎo)致細(xì)胞代謝生長(zhǎng)受限，使得反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量急劇下降，最終反式-4-羥脯氨酸積累量不足18 g/L。

當(dāng)以18 g/L的恒定補(bǔ)糖速率培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵液中的葡萄糖質(zhì)量濃度維持在0.1～0.3 g/L之間，與前2組比較，該組的細(xì)胞濃度和反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量均達(dá)到最大值，反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量高達(dá)42.5 g/L，產(chǎn)酸速率達(dá)到0.966 g/(L·h)，比目前國(guó)際最高水平高125%[9]。同時(shí)，L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到81.1%，最終的產(chǎn)酸量比目前的最高水平高1.5 g/L[10]。當(dāng)以18 g/L的恒定補(bǔ)糖速率培養(yǎng)時(shí)，殘?zhí)俏催^量積累，代謝副產(chǎn)物可得到有效控制。

然而，在發(fā)酵過程中，發(fā)酵后期的溶氧一直維持在10%以下，使得重組菌生長(zhǎng)緩慢，脯氨酸-4-羥化酶的表達(dá)量下降，最終影響產(chǎn)酸，因此，通過提高發(fā)酵液中的溶解氧，是提高產(chǎn)率最直接的方法。在大規(guī)模生產(chǎn)中，提高攪拌轉(zhuǎn)速、維持較高的罐壓和提高通氣量均可獲得較高的溶氧，然而這些改進(jìn)均需要消耗大量的能源和電力，不利于生產(chǎn)成本的控制。有研究報(bào)道通過在菌種中引入血紅蛋白基因，可有效解決供氧不足的問題，在提高菌體比生長(zhǎng)速率的同時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)量也得到提高[19-20]，后期的研究中，可考慮在分子水平上引入透明顫菌血紅蛋白基因，提高氧氣利用率并促進(jìn)脯氨酸-4-羥化酶的表達(dá)。

3 結(jié) 論

利用色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子控制脯氨酸-4-羥化酶基因的表達(dá)，在以葡萄糖為C源，L-脯氨酸為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用勻速補(bǔ)糖策略，最終的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到42.5 g/L，反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)酸速率高達(dá)0.966 g/(L·h)，產(chǎn)酸速率比目前國(guó)際最高水平高125%。

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(責(zé)任編輯 管 珺)

Expression of codon-optimized proline-4-hydroxylase inEscherichia coli and its effect on trans-4-hydroxyproline biosynthesis

LIU Hedong,YUAN Chunwei,ZHANG Zhenyu

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

To improve expression of proline 4-hydroxylase inEscherichiacoli,the DNA sequence encoding proline 4-hydroxylase was adjusted based on the codon bias ofE.coliand the mRNA secondary structure.The optimized proline-4-hydroxylase gene was overexpressed inE.coliBL21(DE3) under a tryptophan tandem promoter in pUC19 vector.In shaking flask culture,trans-4-hydroxyproline was accumulated to (0.492±0.034) g/L in 8 h withL-proline as substrate.For an enhancedtrans-4-hydroxyproline production byE.coliBL21(DE3),the effect of constant feeding strategy ontrans-4-hydroxyproline production in a fermentor was studied.With constant feeding rate at 18 g/h,a maximumtrans-4-hydroxyproline titer of 42.5 g/L with a hightrans-4-hydroxyproline productivity (0.966 g/(L·h)) was achieved.

recombinantEscherichiacoli;proline-4-hydroxylase;trans-4-hydroxyproline;codon optimization;fermentation;optimization

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.009

2013-04-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(30800018、30970058)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(200802951036)；工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金(KLIB-ZR200801)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012554)

劉合棟(1987—)，男，湖北黃石人，碩士研究生，研究方向：基因工程育種、發(fā)酵工程；張震宇(聯(lián)系人)，教授，E-mail:zhangzy@jiangnan.edu.cn

Q786

A

1672-3678(2014)06-0044-08