慢性腎臟病患者及動物模型中成纖維細胞生長因子21的表達及意義

陳 琰，高依依，李占園，葉菡洋，鄭 育，周志宏

成纖維細胞生長因子21(FGF21)是日本學者Nishimura等[1]于2000年發(fā)現(xiàn)的纖維細胞生長因子(FGF)家族中的新成員，已有研究證實FGF21在腎臟組織中有表達，但迄今為止FGF21的確切生物活性及其作用機制仍了解甚少[2]。本研究通過觀察慢性腎臟病(CKD)患者外周血中FGF21的表達差異，并構(gòu)建CKD動物模型以觀察FGF21干預后其腎臟功能和病理改變，以期初步探討FGF21在CKD中的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 臨床研究 選取2012年在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院就診的CKD患者200例，均簽署知情同意書。其中男129例，女71例；平均年齡為(50.2±17.1)歲。根據(jù)估算腎小球濾過率(eGFR)，公式為eGFR =175×〔肌酐(mg/dl)〕-1.234×〔年齡(歲)〕-0.179×性別(男性=1，女性=0.79)，按照《慢性腎臟病及透析的臨床實踐指南》(K/DOQI指南)中CKD診斷標準對患者進行分組：CKD1～2期組(76例)、CKD3～4期組(56例)和CKD5期組(68例)。另選取本院同期體檢證實血、尿常規(guī)，肝、腎功能，血電解質(zhì)，血脂等均在參考范圍內(nèi)的健康成人40例為對照組，其中男26例，女14例；平均年齡為(49.5±12.3)歲。

1.1.2 實驗研究 清潔級雄性8周齡C57BL/6小鼠36只，體質(zhì)量22～24 g，購自北京唯通利華實驗動物技術(shù)有限公司(動物合格證號0300740)。小鼠飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學動物實驗中心，飼養(yǎng)溫度(23±2)℃，相對濕度(55±2)%，定時日光燈照射12 h/d，房間保持通風、恒溫、安靜，定期更換墊料，清洗籠具。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)完全隨機化分組，分為正常對照組(C組)、模型組(M組)、低劑量FGF21干預組(M+L組)和高劑量FGF21干預組(M+H組)，每組9只。給予M組、M+L組、M+H組腺嘌呤混懸液灌胃(第1周及第2～4周給藥劑量分別為250 mg/kg和125 mg/kg，均為每2 d給藥1次，上午給藥)，C組給予等量蒸餾水灌胃。M+L組、M+H組在腺嘌呤混懸液灌胃的基礎(chǔ)上給予FGF21腹腔注射(劑量分別為100 μg/kg和400 μg/kg，均每天上午給藥)，C組、M組給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。

1.2 主要試劑及藥品 腺嘌呤購自上海Sigma公司(批號SLBC1727V)；FGF21免疫組化試劑盒為美國Abcom公司生產(chǎn)；FPG21由溫州醫(yī)學院藥學院提供。

1.3 方法

1.3.1 臨床研究 收集CKD患者的一般資料，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)及既往病史。體檢健康者和CKD患者均空腹至少10 h，然后取外周血標本8.0 ml。將2.5 ml外周血分離血清，按0.2 ml等份分裝，-80 ℃低溫保存。將分離的血樣一份送臨床檢驗室，采用日立7600全自動儀進行各項生化指標檢測(化學試劑法測定)，包括空腹血糖、空腹胰島素、血脂(三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白)、清蛋白、肌酐、尿素氮、尿酸、脂聯(lián)素和FGF21，計算eGFR。血清脂聯(lián)素(R&D，美國)、FGF21(Biovendor，Modrice，捷克)均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定，其測定原理及操作步驟按所購試劑盒相關(guān)說明書進行。

1.3.2 實驗研究 觀察小鼠給藥期間的身體狀況及活動情況，每天記錄攝食量及體質(zhì)量變化。(1)造模4周后處死小鼠，摘除小鼠眼球取血，血標本室溫下2 000 r/min離心10 min，然后取上層血清，用日立7600全自動儀測定其中肌酐、尿素氮、尿酸、清蛋白及FGF21水平。(2)光鏡下腎組織形態(tài)學觀察：造模4周后解剖小鼠并取出雙側(cè)腎臟，經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋，切片厚度為3 μm，采用HE染色及Massion染色法觀察腎組織病理變化。(3)免疫組化檢測腎組織FGF21：石蠟包埋后制片，切片厚度為3 μm，采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物技術(shù)(SABC法)進行免疫組化染色，操作步驟按試劑盒說明書進行。200倍鏡下每張切片隨機找出10個不重疊視野，用醫(yī)學圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0半定量分析，以每個高倍鏡視野下陽性表達的積分吸光度(A)表示FGF21的相對含量。

2 結(jié)果

2.1 臨床研究結(jié)果

2.1.1 受檢者一般資料及生化指標比較 對照組和CKD各期患者年齡、女性比例、BMI、空腹血糖、低密度脂蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而4組空腹胰島素、三酰甘油、高密度脂蛋白、清蛋白、血肌酐、尿素氮、血尿酸、脂聯(lián)素、FGF21水平及eGFR比較，CKD各期糖尿病發(fā)生率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；組間兩兩比較：CKD各期患者三酰甘油、血尿酸水平均高于對照組，清蛋白水平低于對照組；CKD3～4期組、CKD5期組患者空腹胰島素水平高于對照組及CKD1～2期組，而eGFR低于對照組和CKD1～2期組，且CKD5期組患者eGFR亦低于CKD3～4期組；CKD5期組患者高密度脂蛋白水平低于對照組，而脂聯(lián)素水平高于對照組；對照組、CKD1～2期組、CKD3～4期組、CKD5期組血肌酐、尿素氮、FGF21水平依次增加，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1、圖1)。

所有受檢者中，男155例，女85例，男性血清FGF21水平與女性比較，差異無統(tǒng)計學意義〔(826.3±100.4)ng/L與(789.6±86.5)ng/L，t=0.556，P=0.470〕。CKD患者中，合并糖尿病者68例，非糖尿病者132例，二者血清FGF21水平比較，差異有統(tǒng)計學意義〔(1 253.0±170.1)ng/L與(714.0±82.1)ng/L，t=3.125，P=0.002〕。

2.1.2 CKD組患者血清FGF21與各臨床指標間的相關(guān)性 通過對年齡、性別、BMI、糖尿病校正后，相關(guān)分析顯示血清FGF21水平與三酰甘油、血肌酐、尿素氮、脂聯(lián)素呈正相關(guān)(P<0.05)，與低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、eGFR呈負相關(guān)(P<0.05，見表2)。

2.2 實驗研究結(jié)果

2.2.1 小鼠體質(zhì)量及血生化指標變化 可觀察到在同一時間點，相較于C組，M組小鼠稍萎靡、體質(zhì)量下降，活動量減少；M+L組和M+H組小鼠體質(zhì)量較M組下降更明顯，尤其是M+H組小鼠萎靡、體毛干枯不齊，體質(zhì)量下降最顯著(見圖2)。造模后M組小鼠血肌酐、尿素氮、血尿酸水平較對照組升高，提示本實驗造模成功。

表1 各組受檢者臨床資料和生化指標的比較

注：BMI=體質(zhì)指數(shù)，F(xiàn)GF21=成纖維細胞生長因子21，eGFR=估算腎小球濾過率；與對照組比較，*P<0.05；與CKD1～2期組比較，△P<0.05；與CKD3～4期組比較，▲P<0.05；☆為χ2值；-表示無數(shù)據(jù)

注：與對照組比較，*P<0.05；與CKD1～2期組比較，△P<0.05；與CKD3～4期組比較，▲P<0.05

圖1 各組患者血清FGF21水平的比較

Figure1 Comparison of serum FGF21 concentration among different patient groups

表2 血清FGF21水平與各指標的相關(guān)性分析

注：*表示對年齡、性別、BMI、糖尿病校正后行Pearson相關(guān)分析；-表示無數(shù)據(jù)

M組、M+L組、M+H組小鼠清蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而3組血肌酐、尿素氮、血尿酸水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中，與M組比較，F(xiàn)GF21干預后小鼠血肌酐、尿素氮、血尿酸水平升高，且M+H組上述3項腎功能指標較M+L組惡化，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

2.2.2 各組小鼠光鏡下腎組織病理改變 HE染色及Massion染色結(jié)果顯示，M組小鼠部分腎小球系膜區(qū)細胞增生，基質(zhì)增多，部分腎小管上皮細胞腫脹、空泡變性，腎間質(zhì)有炎性細胞浸潤；FGF21干預后，腎臟病理損傷面積及程度加重，M+H組小鼠腎小球部分萎縮，腎小管擴張變形并萎縮明顯，部分腎間質(zhì)彌漫炎性細胞浸潤，亦可見蛋白、細胞管型(見圖3)。

2.2.3 免疫組化檢測各組小鼠腎組織中FGF21的表達 與C組比較，M組小鼠腎組織中FGF21表達明顯升高；FGF21干預后，當FGF21干預劑量增加時，腎組織中FGF21表達亦升高(見圖4)。

圖2 各組小鼠體質(zhì)量變化

表3 各組小鼠腎功能指標比較

注：與M組比較，*P<0.05；與M+L組比較，△P<0.05

3 討論

近年來雖然對腎臟疾病的認識有了迅速的進展，但在發(fā)病機制及易患因素方面仍所知甚少，已經(jīng)確認的是腎小球疾病多為免疫介導炎癥性疾病或代謝異常所致疾病[3]。近期的研究證實FGF21具有內(nèi)分泌因子的功能，參與機體物質(zhì)代謝，維持機體內(nèi)脂糖代謝的平衡。當前有限的動物實驗研究主要是集中體現(xiàn)FGF21在體內(nèi)脂糖代謝調(diào)控方面的作用[4-5]。目前已證實FGF21在腎臟中有表達，但在CKD的進展中其表達的變化及作用機制尚不清楚，值得研究。

目前，最新的研究僅顯示在長期血液透析患者也就是腎功能嚴重受損的患者中，F(xiàn)GF21水平顯著增加[6]。本研究也顯示CKD5期患者血清FGF21水平明顯上升，并顯著高于CKD1～2期和CKD3～4期患者；同時血清FGF21水平還與eGFR呈負相關(guān)，與血肌酐、尿素氮呈正相關(guān)，提示隨著CKD患者的疾病進展，血清FGF21水平逐漸增高。故推斷隨著腎功能的惡化，血清FGF21生理水平會相應(yīng)調(diào)節(jié)。并且本研究觀察到CKD1～2期患者血清FGF21水平已開始升高，隨著eGFR的下降呈進行性遞增，故認為FGF21可能是一個敏感的提示腎功能變化的生物學標志物。但是FGF21在CKD患者中體內(nèi)表達增加的意義尚未明確，其水平升高是抵抗腎功能惡化的一種適應(yīng)性反應(yīng)，還是在腎功能惡化過程中起推動因素的因子，是本研究下一個需要解答的問題。

圖3 4組小鼠光鏡下腎組織病理改變(HE，×100)

Figure3 The pathological change of renal tissue in 4 rat groups under light microscope

圖4 4組小鼠腎組織FGF21表達(免疫組化，×200)

Figure4 The expression of FGF21 in renal tissues of 4 rat groups

故在實驗研究中，建立CKD動物模型，并給予不同劑量的FGF21干預。結(jié)果顯示，高劑量FGF21干預的小鼠血清和腎組織中FGF21的表達均增加，且小鼠出現(xiàn)腎功能惡化及腎臟病理顯著損傷，故提出假設(shè)——FGF21在腎臟病變中可能為損傷因子，其高濃度表達反而促進腎單位損傷加重。有研究顯示，在高血壓患者中FGF21也呈現(xiàn)高表達狀態(tài)[7]，故懷疑FGF21是否與腎小球囊內(nèi)高壓有一定相關(guān)性。目前，隨著對FGF21研究深入，已顯示FGF21可能是作為一個自分泌/旁分泌細胞因子發(fā)揮作用[8]，故有理由相信FGF21可能通過多途徑影響了腎臟功能代謝，其具體的作用機制仍不明確，也值得繼續(xù)深入研究。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)合并糖尿病的CKD患者血清FGF21水平顯著高于非糖尿病CKD患者，血清FGF21水平與三酰甘油、脂聯(lián)素呈正相關(guān)，證實了FGF21在機體內(nèi)糖脂代謝方面起積極作用[9]。

綜上所述，隨著腎功能的惡化，血清FGF21水平逐漸升高，并且FGF21高表達可能進一步促進腎單位損傷。近年來已有研究者致力于實現(xiàn)人源FGF21的高效表達[10]，因此，揭示FGF21在CKD發(fā)病機制中作用值得進一步研究，同時為早期診治CKD提供實驗理論基礎(chǔ)。

1 Nishimura T，Nakatake Y，Konishi M，et al.Identification of a novel FGF，F(xiàn)GF-21，preferentially expressed in the liver[J].Biochim Biophys Acta，2000，1492(1)：203-206.

2 Kliewer SA，Mangelsdorf DJ.Fibroblast growth factor 21：from pharmacology to physiology[J].Am J Clin Nutr，2010，91(1)：254-257.

3 Filiopoulos V，Vlassopoulos D.Inflammatory syndrome in chronic kidney disease：pathogenesis and influence on outcomes[J].Inflamm Allergy Drug Targets，2009，8(5)：369-382.

4 Wente W，Efanov AM，Brenner M，et al.Fibroblast growth factor-21 improves pancreatic beta-cell function and survival by activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and Akt signaling pathways[J].Diabetes，2006，55(9)：2470-2478.

5 Kharitonenkov A，Shanafelt AB.FGF21：a novel prospect for the treatment of metabolic diseases[J].Curr Opin Investig Drugs，2009，10(4)：359-364.

6 Stein S，Bachmann A，Lossner U，et al.Serum levels of the adipokine FGF21 depend on renal function[J].Diabetes Care，2009，32(1)：126-128.

7 Semba RD，Crasto C，Strait J，et al.Elevated serum fibroblast growth factor 21 is associated with hypertension in community-dwelling adults[J].Hum Hypertens，2013，27(6)：397-399.

8 Johnson CL，Weston JY，Chadi SA，et al.Fibroblast growth factor 21 reduces the severity of cerulein-induced pancreatitis in mice[J].Gastroenterology，2009，137(5)：1795-1804.

9 Seo JA，Kim NH.Fibroblast growth factor 21：a novel metabolic regulator[J].Diabetes Metab J，2012，36(1)：26-28.

10 Zhao Y，Dunbar JD，Kharitonenkov A.FGF21 as a therapeutic reagent[J].Adv Exp Med Biol，2012，728：214-228.