農(nóng)桿菌介導棉花和玉米非組培轉化方法探索

劉新星，羅俊杰，陳玉梁，陳子萱，裴懷弟，李忠旺

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，甘肅蘭州 730070）

農(nóng)桿菌介導棉花和玉米非組培轉化方法探索

劉新星，羅俊杰，陳玉梁，陳子萱，裴懷弟，李忠旺

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，甘肅蘭州 730070）

采用農(nóng)桿菌介導植物萌發(fā)種子基因轉化方法，在棉花和玉米上轉化外源目的基因，進行非組培轉化法的探索。結果表明，針刺對棉花和玉米種子的萌發(fā)沒有影響，但對2種作物的出苗率有明顯抑制作用。轉化過程中，棉花的共培養(yǎng)時間不宜超過24 h，玉米不宜超過48 h。經(jīng)大田篩選及PCR檢測，棉花未獲得轉化植株，玉米獲得轉化植株共7株，轉化率達0.14%，其中加入AS（乙酰丁香酮）的處理獲得6株，不加AS處理獲得1株。

非組培轉化；農(nóng)桿菌介導；轉化率；棉花；玉米

近年來，植物基因工程技術取得了重要進展，在農(nóng)作物品種改良和育種方面發(fā)揮著越來越重要的作用。目前植物遺傳轉化所采用的受體系統(tǒng)，大都依賴于細胞組織培養(yǎng)技術才能獲得轉基因植株，周期長并存在一定的局限性。因而，一些非組培的轉化方法近年來迅速發(fā)展起來［1］，萌動種胚法就是其中一種。剛剛萌動的種胚是最理想的感受態(tài)之一［2～3］，如果在種子吸脹過程中，輔以劃胚處理，從而使細菌有更多的機會進入萌發(fā)胚，使整個胚萌動與發(fā)育這個細胞生長分化極其活躍的過程（2～3 d）均在菌液中進行，萌發(fā)胚的生長點將極易被轉化［4］。萌動種胚法主要利用種子萌動時細胞分裂加快、生活力旺盛、具最佳感受態(tài)的特點，一方面靠吸脹作用吸入外源DNA，另一方面輔助劃胚露出生長點，在AS（乙酰丁香酮）作用下，通過活體農(nóng)桿菌對傷口的侵襲作用，從而形成轉化分生組織及新的生長點，分化出轉化苗。AS是一種酚類化合物，可誘發(fā)農(nóng)桿菌內Ti或Ri質粒DNA上Vir區(qū)基因的活化和高效表達，現(xiàn)已被廣泛應用于農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化中［5］。孫毅等發(fā)明了農(nóng)桿菌介導植物萌發(fā)種子基因轉化方法，已申報中國、美國、加拿大和歐洲發(fā)明專利［6］。梁雪蓮對玉米的試驗證實，此種轉化方法既省去繁瑣漫長的組培過程，又可獲得高于基因槍10倍以上的轉化率［7］。該方法在玉米上已試驗成功，棉花上還沒有相關報道。鑒于目前棉花轉化困難的最主要原因是難以組培和基因型依賴性強，我們擬利用非組培途徑萌動種胚法轉化棉花，采用棉花和玉米作為試驗材料，試圖取得在棉花遺傳轉化上的突破。

1 材料與方法

1.1 供試材料及預處理

1.1.1 供試材料指示棉花品種為隴綠棉3號，玉米品種為隴單023，均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所提供。根癌農(nóng)桿菌為LBA4404，所用的植物表達載體為PBI121。

1.1.2 材料預處理精選經(jīng)硫酸脫絨后的棉花種子，先用70%乙醇涮洗30 s，再用30%過氧化氫浸泡3 h，后用無菌水沖洗5～8遍，在無菌水中浸泡12～16 h催芽至種子露白，于超凈工作臺中剝去種皮。用無菌針灸用針在種子胚芽生長點刺2～3下，備用。挑選籽粒飽滿的玉米種子，先用70%乙醇浸泡3min，再用1 g/kg升汞消毒10 min，后用無菌水沖洗3～5次，在無菌水中浸泡5～6h，于超凈臺里用無菌針灸用針在胚芽刺2～3下，備用。

1.1.3 菌液準備將儲存在-70℃冰箱的原始菌液，在含有相應抗生素的YEB平板上進行畫線培養(yǎng)，28℃黑暗培養(yǎng)2 d。挑取平板上的單菌落加入含有相應抗生素的5 mL YEB液體培養(yǎng)基中，在220 r/min，28℃的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將菌體按1∶50的比例進行二次活化，活化好的菌液離心后用MSB液體重懸菌體，作為共培養(yǎng)液備用。棉花選用卡那霉素為抗性篩選基因的菌液進行介導，玉米選用Basta除草劑為抗性篩選基因的菌液進行介導。

1.2 PCR分子檢測

采集抗性植株和未轉化植株的新鮮葉片，棉花采用本實驗室改良的方法提取基因組DNA［8］，玉米使用試劑盒提取基因組DNA，進行PCR鑒定。

1.3 實驗設計

1.3.1 針刺與菌液共培養(yǎng)對種子萌發(fā)和出苗的影響取未預處理和經(jīng)過預處理的棉花種子和玉米種子各100粒，每處理分別置于有菌液的培養(yǎng)皿中黑暗培養(yǎng)，第3天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)。后將發(fā)芽的種子播種于含有蛭石的營養(yǎng)缽中，14 d后統(tǒng)計出苗數(shù)。

1.3.2 共培養(yǎng)時間對種子萌發(fā)的影響選取經(jīng)過預處理的棉花和玉米種子各150粒，每處理50粒種子，分別放入相應制備好的共培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，在搖床110 r/min下共培養(yǎng)24、36、48 h。然后用無菌水反復沖洗殘留菌液，置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿內進行催芽，統(tǒng)計分析共培養(yǎng)時間對種子萌發(fā)的影響。

1.3.3 AS（乙酰丁香酮）對轉化率的影響共設2個處理，處理1在配制好的菌液中加入200 μmol/L AS，處理2不加AS，2次重復。將經(jīng)過預處理的玉米、棉花種子各1 000粒按實驗設計放置于相應菌液中，在搖床110 r/min下玉米培養(yǎng)48 h、棉花培養(yǎng)24 h，然后用無菌水反復沖洗殘留菌液，置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿內進行催芽，待芽長1～2 cm時播種于溫室營養(yǎng)缽內，缽內為澆有營養(yǎng)液的蛭石。在溫室內生長至3～5片葉時進行抗生素涂抹。棉花用3 000 mg/L的卡那霉素篩選，玉米用0.2%Basta除草劑進行篩選。統(tǒng)計加入AS對棉花和玉米轉化率的影響。

1.3.4 棉花鑒定抗性植株的篩選時期將經(jīng)過預處理的棉花種子在制備好的共培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，在搖床110 r/min下培養(yǎng)24 h，卡那霉素設0、100、200、300、400、500 mg/L6個濃度處理，按設計在MS培養(yǎng)基中分別加入相應濃度的卡那霉素，每處理接種50粒棉花種子于黑暗培養(yǎng)，2次重復，7 d后統(tǒng)計發(fā)芽率。

2 結果與分析

2.1 針刺與菌液共培養(yǎng)對種子萌發(fā)和出苗的影響針刺對種子的胚有傷害作用，因而影響到種子的萌發(fā)和出苗率，不同作物種子受針刺后表現(xiàn)也不同。從表1可以看出，針刺與菌液共培養(yǎng)對2種作物種子的萌發(fā)影響不大，對2種作物的出苗率有明顯抑制作用。其中玉米的出苗率為23%，棉花出苗率略低，為17%，均較正常種子菌液培養(yǎng)降低72百分點。觀察發(fā)現(xiàn)，針刺與菌液共培養(yǎng)對棉花幼苗的后期生長有明顯的影響，表現(xiàn)為幼苗子葉發(fā)黃發(fā)枯，新葉生長緩慢，植株生長停滯或逐漸死亡，能夠正常生長至3～5片葉的幼苗僅占6%。

表1 針刺與菌液共培養(yǎng)對種子發(fā)芽數(shù)和出苗數(shù)的影響

2.2 共培養(yǎng)時間對種子萌發(fā)的影響

觀察表明，棉花種子與菌液共培養(yǎng)時間不宜超過24 h，共培養(yǎng)時間為48、60 h處理的種子全部返菌霉變，不能萌發(fā)。玉米種子與菌液共培養(yǎng)時間不宜超過48 h，共培養(yǎng)時間為60 h時，種子感菌不易控制，導致種子霉爛死亡。過長時間與菌液共培養(yǎng)會使種子腐爛發(fā)霉而不能萌發(fā)出苗，這是因為液體中菌體太多，需氧量增大，種子萌發(fā)所需的關鍵要素氧氣供應不足。

2.3 AS（乙酰丁香酮）對轉化率的影響

實驗結果（表2）表明，在菌液中加入200μmol/L AS，可以顯著提高轉化率，得到更多的抗性植株。棉花中加AS處理下獲得5株抗性植株，不加AS處理下未獲得抗性植株。玉米中加入AS的處理比不加AS處理獲得的抗性植株數(shù)提高3倍。2.4棉花鑒定抗性植株的篩選時期

表2 添加AS（乙酰丁香酮）處理的種子轉化率

從表3看出，加入不同濃度卡那霉素，棉花種子的發(fā)芽率與對照相比無明顯差異，均能正常萌發(fā)出苗。這與王成杰在小麥非組培轉化中的結果一致［9］，說明棉花種子與小麥種子一樣，在含有抗性篩選素的平板上萌發(fā)差異不明顯，達不到篩選目的。因此，棉花只能在萌發(fā)后苗期及其它生育期進行抗性植株篩選。2.5轉化植株檢測

表3 不同濃度卡那霉素培養(yǎng)上棉花種子的發(fā)芽率

共轉化棉花萌動胚3 000個，獲得抗性植株17株，經(jīng)PCR檢測未得到陽性植株。共轉化玉米萌動胚5 000個，獲得抗性植株30株，根據(jù)PCR檢測結果（圖1）獲得7株陽性植株，其中添加200 μmol/L AS處理下獲得6株，未添加AS處理下獲得1株，轉化率共計0.14%。

圖1 轉基因玉米植株PCR檢測

3 小結與討論

1）實驗結果表明，針刺對棉花和玉米種子的萌發(fā)基本沒有影響，但對2種作物的出苗率有明顯抑制作用。轉化過程中，與菌液共培養(yǎng)的時間因作物品種而異，棉花共培養(yǎng)時間不宜超過24 h，玉米則不宜超過48 h，時間太短使轉化效率降低，過長種子易腐爛，移栽后很難成活。經(jīng)大田篩選及PCR檢測，棉花未獲得轉化植株，玉米獲得轉化植株共7株，轉化率達0.14%，其中加入AS（乙酰丁香酮）的處理下獲得6株，不加AS處理下獲得1株。此方法操作性強，大大優(yōu)于愈傷轉化，不依賴組培技術，結果穩(wěn)定，很值得推廣。

2）作物種子吸水后，胚內的酶活動加強，呼吸作用驟然上升，糖類、蛋白質以及核酸的合成和轉變也迅速地進行。這時的萌動種胚對外界因子的反應十分敏感，胚性細胞開始處于分裂狀態(tài)，子葉對胚芽的包裹不再嚴密。此時利用高活力的農(nóng)桿菌感染處理萌動種胚并進而與之共培養(yǎng)，有利于對種胚生長點的轉化，因為宿主細胞DNA的合成和分裂是農(nóng)桿菌成功轉化的一個重要因素。此外萌動種胚的微傷處理不僅利于細菌附著和進入宿主細胞，而且AS可誘導Ti質粒VIR區(qū)基因活化［10］。

3）應用農(nóng)桿菌轉化萌動種胚時，劃胚技術和工具是關鍵，需要一定的熟練程度，這樣才不至于嚴重影響劃胚種子的萌發(fā)和出苗［11］。針刺的深度對轉化也有很大影響，過深會使胚喪失活性，而過淺則減少農(nóng)桿菌感染的機會。不同的種子形狀、胚的不同位置、種皮厚薄都影響劃胚操作，這些因素的優(yōu)化還有待進一步試驗。

4）雖然這種轉化方法具有省時、省工和效率較高等優(yōu)點，但也存在一些問題。這種方法的轉化植株可能是嵌合體，會不會穩(wěn)定的進行遺傳，需要進一步研究。同時這種方法的轉化效率相對較低，本研究中棉花沒有獲得轉化植株也表明該方法可能不適用于部分植物，需要繼續(xù)研究影響轉化的因素，提高轉化效率［12］?？傊?，高的轉化率得益于農(nóng)桿菌生物轉化、AS的誘導及萌動種胚感受態(tài)三者綜合作用的結果。

［1］任海紅，任小俊，王英，等.非組培遺傳轉化法在農(nóng)作物上的應用［J］.山西農(nóng)業(yè)科學，2010，38（11）：85-88.

［2］許耀，王艇，李寶健.根癌農(nóng)桿菌介導的外源基因轉化植物萌動種胚的研究［J］.實驗生物學報，1991，24（2）：109-114.

［3］楊劍波，許智宏，衛(wèi)志明，等.影響根癌農(nóng)桿菌附著禾谷類作物培養(yǎng)細胞的因素［J］.實驗生物學報，1993，26（1）：1-6.

［4］SMITH R，HOOD EE.Agrobacterium tumefaciens transformation of monocotyledons［J］.Crop Science，1995，35：301-309.

［5］鄧藝，曾炳山，趙思東，等.乙酰丁香酮在農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化中的作用機制及應用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（5）：2 229-2 232

［6］孫毅，王景雪，劉少翔，等.農(nóng)桿菌介導植物萌發(fā)種子基因轉化方法：中國，01104185［P］.2001-07-11.

［7］梁雪蓮.農(nóng)桿菌組培及三種非組培法在小麥和玉米上轉化外源Bar基因研究［D］.晉中：山西農(nóng)業(yè)大學，2002.

［8］李忠旺，厚毅清，石有太，等.棉花基因組DNA快速提取方法改良［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2012（4）：11-14.

［9］王成杰.農(nóng)桿菌介導小麥非組培轉化方法的探討［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2004.

［10］楊云霞.小麥農(nóng)桿菌介導不同遺傳轉化體系的建立及比較研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2005.

［11］杜建中，孫毅，郝曜山，等.非組培轉化法獲得轉基因植株及其Basta耐受性研究［J］.西北植物學報，2012，32（2）：231-240.

［12］王昌濤，趙玉錦，李坤遠，等.農(nóng)桿菌介導玉米萌動胚遺傳轉化新體系的建立［J］.華北農(nóng)學報，2007，22（5）：110-113.

（本文責編：陳偉）

Exploration of the Non-tissue Culture Methods By Agrobacterium-mediated in Cotton and Corn

LIU Xin-xing，LUO Jun-jie，CHEN Yu-liang，CHEN Zi-xuan，PEI Huai-di，LI Zhong-wang
（Institute of Biotechnology，Gansu Academy of Agriculture Sciences，Lanzhou Gansu 730070，China）

We use a new genetic transformation method by agrobacterium-mediated in germinating embryo of cotton and corn intentioned with Sunyi，to explorated and researched of non-tissue culture transformation.The results shows that the acupuncture has no effect on cotton and corn seed germination，but the germination rate was significantly inhibited in two crops.In transformation process，the co-cultivation timein cotton should not exceed a total of 24 hours，corn should not exceed 48 hours；After field screening and PCR testing，the cotton have not got transformed plants，the corn obtained seven and the conversion rate was 1.4%，in which have six under added AS（acetosyringone）treatment，have one without AS treatment.

Non-tissue culture；Agrobacterium-mediation；Conversion rate；Cotton；Corn

Q781

A

1001-1463（2014）11-0011-04

10.3969/j.issn.1001-1463.2014.11.004

2014-10-10

甘肅省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新專項（2012GAAS15-6；2012GAAS12-2）部分內容

劉新星（1986—），女，甘肅平?jīng)鋈耍芯繉嵙晢T，主要從事作物生理生態(tài)與生物技術研究。聯(lián)系電話：（0931）7612683。E-mail：lxx19860621@163.com

羅俊杰（1962—），男，陜西華縣人，研究員，主要從事作物生理生態(tài)與培育工作。E-mail：hnsljjie@163.com