抗氧化成分白藜蘆醇的樹(shù)脂分離工藝研究

鄧義德易躍能徐月?tīng)N，2陳 鋒肖滿意劉湘榮

（1湖南希爾藥物研究有限公司，長(zhǎng)沙，410205；2湖南希爾天然藥業(yè)有限公司，永州，425000）

抗氧化成分白藜蘆醇的樹(shù)脂分離工藝研究

鄧義德1易躍能1徐月?tīng)N1，2陳 鋒1肖滿意1劉湘榮1

（1湖南希爾藥物研究有限公司，長(zhǎng)沙，410205；2湖南希爾天然藥業(yè)有限公司，永州，425000）

目的：研究大孔吸附樹(shù)脂分離純化虎杖中白藜蘆醇的工藝條件及參數(shù)。方法：利用白藜蘆醇顯酸性的特點(diǎn)，采用堿液洗脫樹(shù)脂法分離純化白藜蘆醇?？疾?種樹(shù)脂、堿的濃度以及洗脫流速等因素對(duì)白藜蘆醇分離純化的影響。結(jié)果：選擇NKA-Ⅱ樹(shù)脂，NaOH洗脫液濃度0.5%，流速為1 BV/h，經(jīng)過(guò)去鹽后，白藜蘆醇純度達(dá)到70%以上。結(jié)論：該工藝適用于對(duì)白藜蘆醇有吸附的樹(shù)脂，經(jīng)過(guò)一次上柱就可以與原料中其他干擾成分分離，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

白藜蘆醇；虎杖；大孔吸附樹(shù)脂；堿

虎杖為蓼科蓼屬多年生草本植物（Polygonum CuspidatumSieb.et Zucc）的干燥根莖和根，是我國(guó)的一種傳統(tǒng)中藥［1-2］，具有祛風(fēng)利濕，散瘀定痛，止咳化痰等功效?，F(xiàn)代藥學(xué)研究證明其具有多種藥理作用，主要表現(xiàn)在抗癌和抗心血管疾病兩個(gè)方面［3-4］。虎杖中含有芪類化合物、蒽醌類化合物、黃酮類化合物、水溶性多糖、鞣質(zhì)和微量元素等成分［5］，其主要活性成分白藜蘆醇（Resveratrol）是一種多酚物質(zhì)，生產(chǎn)工藝一般采用大孔吸附樹(shù)脂分離純化白藜蘆醇，但易受到蒽醌類、虎杖苷等的干擾，需要用不同濃度的乙醇洗脫，重復(fù)多次地上柱。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)白藜蘆醇的特點(diǎn)，使用堿液洗脫，取得了良好的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 虎杖購(gòu)自長(zhǎng)沙市高橋中藥材專業(yè)市場(chǎng)，產(chǎn)自廣西，經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部虎杖項(xiàng)下規(guī)定；白藜蘆醇對(duì)照品為自制（含量98.7%）；酒曲（安琪酵母股份有限公司）；硅膠G254（青島海洋化工廠分廠）；S-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、X-5、D101樹(shù)脂（天津南開(kāi)大學(xué)化工廠）；AB-8樹(shù)脂（西安電力樹(shù)脂廠）；氫氧化鉀、氫氧化鈉（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；甲醇、乙醇、鹽酸等試劑為分析純；乙腈（色譜純），水為娃哈哈純凈水。

Agilent1260高效液相色譜儀；AG285分析天平（德國(guó)梅特勒公司，精密度：d＝0.01 mg）；DZF-6050真空干燥箱（上海瑯軒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；EYELA SB-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；超聲清洗器（寧波科生儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 上柱液的制備［6-10］稱取虎杖粉末，加入藥材重的0.5%酒曲，用0.1 mol/L HCl調(diào)pH值至5，于40℃下酶解3 h。酶解后加入10倍量80%乙醇，70℃回流提取2次，2 h/次，過(guò)濾液回收乙醇，剩余液備用。1.2.2 分析方法［11-13］

1.2.2.1 色譜條件 Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)307 nm；流速為1 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取7.5 mg白藜蘆醇對(duì)照品，加無(wú)水甲醇50 m L配制成0.15 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0mL置10mL容量瓶中，無(wú)水甲醇定容至刻度。依次取10μL進(jìn)樣，每個(gè)濃度重復(fù)3次，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，得回歸方程y＝238 722x-459 7，r＝0.999 7，線性范圍為白藜蘆醇0.15～0.75μg。

1.2.3 大孔吸附樹(shù)脂的選擇［14-22］樹(shù)脂的吸附性能對(duì)白藜蘆醇的純化影響很大，不同的樹(shù)脂純化效果有較大差別。試驗(yàn)測(cè)定了6種樹(shù)脂靜態(tài)吸附量、吸附率和解吸率，比較他們的吸附率和解吸率，選擇出較為理想的樹(shù)脂。精確稱取經(jīng)預(yù)處理的一定質(zhì)量的6種樹(shù)脂，置于具塞的錐形瓶中，加入40 mL的虎杖上柱液，于室溫下連續(xù)振蕩24 h，轉(zhuǎn)速為130 r/min，測(cè)定吸附前后白藜蘆醇濃度的變化，按下式計(jì)算各樹(shù)脂的靜態(tài)吸附容量和吸附率，然后用60%乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，測(cè)定脫附液中白藜蘆醇的含量，按下式計(jì)算解吸率。

吸附量（mg/g干樹(shù)脂）＝（C0-Ce）×VA/W

吸附率＝（C0-Ce）/C0×100%

解吸率＝CD×VD/［（C0-Ce）×VA］×100%

式中C0為吸附液起始濃度，Ce為吸附平衡濃度，VA為吸附液體積，W為樹(shù)脂質(zhì)量，CD為脫附液濃度，VD為脫附液體積。

1.2.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 取1 g樹(shù)脂加入40 mL 0.92 mg/mL白藜蘆醇溶液，在不同時(shí)刻取少量溶液分析白藜蘆醇質(zhì)量濃度，以吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)做出樹(shù)脂的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。取1 g樹(shù)脂加入40 mL系列質(zhì)量濃度的白藜蘆醇溶液，進(jìn)行吸附試驗(yàn)，測(cè)定吸附前后的溶液中白藜蘆醇質(zhì)量濃度，計(jì)算樹(shù)脂吸附量。

1.2.5 解吸條件的選擇 對(duì)已經(jīng)吸附樣品的樹(shù)脂進(jìn)行脫附試驗(yàn)，作出解吸曲線?？疾靿A液濃度、流速等因素對(duì)樹(shù)脂脫附性能的影響，確定最佳的工藝條件。

2 結(jié)果

2.1 樹(shù)脂的篩選結(jié)果 在相同試驗(yàn)條件下，測(cè)得各樹(shù)脂的靜態(tài)吸附及脫附，結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)表1綜合樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇吸附和解吸性能的考慮，選用NKA-Ⅱ樹(shù)脂來(lái)考察分離純化虎杖中白藜蘆醇的工藝。

2.2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程 配制濃度為0.92 mg/mL白藜蘆醇溶液40 mL，加入已處理好的1gNKA-Ⅱ樹(shù)脂，在不同時(shí)刻取少量溶液分析白藜蘆醇濃度，繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，開(kāi)始階段，隨吸附時(shí)間增加吸附率快速增加，吸附時(shí)間越長(zhǎng)，吸附越接近平衡，150 min開(kāi)始，吸附量增加緩慢。

2.3 上樣濃度對(duì)吸附效果的影響 配制6份不同濃度的上柱液，每份均超樹(shù)脂的飽和吸附量，結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，隨著溶液中白藜蘆醇濃度的增加，樹(shù)脂的吸附量增加很快，當(dāng)濃度≥800 mg/L后，吸附量趨于平穩(wěn)。

表1 6種樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的吸附、解吸性能

圖1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程曲線

圖2 上樣濃度對(duì)吸附效果的影響曲線

2.4 洗脫劑濃度對(duì)NKA-Ⅱ樹(shù)脂動(dòng)態(tài)脫附性能的影響 實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用特定濃度強(qiáng)堿溶液洗脫，可以很好地分離蒽醌類、白藜蘆醇苷等干擾成分。將已吸附好樣品的樹(shù)脂用5個(gè)NaOH梯度濃度進(jìn)行洗脫，檢測(cè)洗脫液的白藜蘆醇濃度，計(jì)算洗脫率，結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。從表2數(shù)據(jù)、圖3可以看出，當(dāng)NaOH洗脫濃度≥0.5%時(shí)，白藜蘆醇的洗脫率有很大程度的提升，也減少了洗脫溶劑；同時(shí)白藜蘆醇與其他干擾成分得到分離，提高了產(chǎn)品中白藜蘆醇的純度，考慮到堿濃度大對(duì)生產(chǎn)設(shè)備的損耗，確定將0.5%的NaOH溶液作為洗脫液。

表2 洗脫劑濃度對(duì)洗脫性能的影響

圖3 不同NaOH洗脫濃度得到的樣品TLC圖譜

2.5 洗脫液流速的確定 平行裝4支NKA-Ⅱ樹(shù)脂柱，用3.5BV 0.5%NaOH洗脫液按不同流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測(cè)定白藜蘆醇濃度，計(jì)算解吸率，結(jié)果見(jiàn)圖4。表明低流速有利于提高白藜蘆醇的解吸率，在1.0 BV/h的流速下，洗脫率達(dá)到91.7%，從提高生產(chǎn)效率出發(fā)，確定洗脫流速為1.0BV/h。

圖4 洗脫流速對(duì)洗脫率的影響

2.6 產(chǎn)品純度的測(cè)定 按優(yōu)選工藝條件，收集堿洗脫液，用稀鹽酸調(diào)pH值至5，對(duì)水透析24 h，濃縮、真空干燥，經(jīng)高效液相色譜測(cè)定產(chǎn)品中白藜蘆醇純度為79.1%，見(jiàn)圖5-C。

3 結(jié)論

1）本實(shí)驗(yàn)利用白藜蘆醇的顯酸性的特點(diǎn)，通過(guò)試驗(yàn)的篩選，確定在0.5%濃度的NaOH溶液洗脫條件下，產(chǎn)品中白藜蘆醇純度為79.1%。該工藝具有一次上柱與其他干擾成分分離的效果，在提高白藜蘆醇純度的同時(shí)，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。

2）達(dá)到一定的堿濃度下，對(duì)考察的其他5種樹(shù)脂也做了優(yōu)選工藝條件的驗(yàn)證試驗(yàn)，白藜蘆醇均能與干擾物質(zhì)分離，達(dá)到較高的純度。

3）關(guān)于洗脫原理有待進(jìn)一步的研究，可能與改變樹(shù)脂的吸附性能有關(guān)，但與堿液降低樹(shù)脂的吸附能力又有差異，因?yàn)樵谶x擇的堿液濃度下，虎杖苷及蒽醌類物質(zhì)并沒(méi)有洗脫下來(lái)，針對(duì)性比較強(qiáng)。

圖5 產(chǎn)品的HPLC圖譜

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（2013-11-12收稿 責(zé)任編輯：曹柏）

Optim ization of the Purification Techniques of Resveratrol by M acroporous Adsorption Resin

Deng Yide1，Yi Yueneng1，Xu Yuecan1，2，Chen Feng1，Xiao Manyi1，Liu Xiangrong1
（1 Hunan Hill Natural Pharmaceutical Co．Ltd．，Changsha 410205，China；2 Hunan Hill NaturalsCo．Ltd．，Yongzhou 425000，China）

Objective：To explore purification techniques of Resveratrol bymacroporous adsorption resin.Methods：As resveratrol is acidic，lye elution resin separation and purification was used.The impact of resin types，NaOH concentration，flow rate on purification resultswere explored.Results：The optimized purification techniques was：NKA-Ⅱresin，eluent concentration of NaOH 0.5%，flow rate＝1BV/h，after desalting，resveratrol purity＞＝70%.Conclusion：The optim ized purification techniques is applicable to adsorption resin that is resveratrol adsopting，separation with other ingredients can be achieved by one flow，it is suitable formass production.

Resveratrol；Cuspidatum；Macroporous resin；A lkali

R331；R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.10.032

鄧義德（1981—），男，工程師，研究方向：中藥資源開(kāi)發(fā)與利用，E-mail：dyidandg2008＠163.com

易躍能，執(zhí)業(yè)藥師，在讀博士后，主要從事新藥研究工作，Tel：（0731）82193577，E-mail：yiyueneng＠163.com