痰瘀同治對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響*

薛金貴 王玉琦 郭 煒 高俊杰 蘭德輝 沈智杰 戎靖楓 陳鐵軍 王肖龍 周 華

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）斑塊的產(chǎn)生和發(fā)展是造成血管狹窄的主要因素，而斑塊的不穩(wěn)定甚至破裂是引起急性冠脈綜合征（包括不穩(wěn)定型心絞痛和心肌梗死）的罪魁禍?zhǔn)?。已有研究提示AS斑塊的形成與炎細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)皮細(xì)胞破壞，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖、遷移等有關(guān)。中醫(yī)藥對(duì)延緩或逆轉(zhuǎn)AS斑塊進(jìn)展的研究尚不多。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，痰瘀互結(jié)是許多冠心病患者的主要病機(jī)，痰瘀同治可明顯緩解心絞痛。丹蔞片是痰瘀同治的代表方劑，在治療冠心病、穩(wěn)定AS斑塊等方面有較為顯著的療效，但機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)血管平滑肌原代細(xì)胞，血小板衍生因子BB型（PDGF-BB）誘導(dǎo)其增殖，通過(guò)MTT法觀(guān)察中成藥丹蔞片藥物血清作用下，VSMC增殖的情況，并闡述其可能機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物 雄性 SD 大鼠，體質(zhì)量（180±20） g，6～8 周齡，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào) SCXK（滬）2008-0016。

1．2 儀器與試藥 細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司，型號(hào)HERAcell150）；倒置生物顯微鏡（重慶光電）；超凈臺(tái)（蘇州安泰空氣凈化有限公司，型號(hào)BHC-1300IIA/B3）；流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur E97501326）；酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；熒光顯微鏡（Olympus美國(guó)）；離心機(jī)（eppendorf美國(guó)）。 DMEM（低糖）培養(yǎng)基、PBS、FBS、0．25%胰酶（corning cellgro USA，均購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)有限公司）；青霉素、鏈霉素、二甲基亞砜、細(xì)胞固定液、細(xì)胞封片液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、抗小鼠-FITC免疫熒光試劑盒、α-actin SM specific一抗、RNASE、PI、MTT粉末 （均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1．3 含藥血清制備 丹蔞片（吉林康乃爾藥業(yè)有限公司）置于研缽中磨粉，精密天平稱(chēng)取18．8 g溶于200mL無(wú)菌注射用水中，磁力攪拌20min，充分溶解，過(guò)200目篩網(wǎng)去渣，置于4℃冰箱備用。根據(jù)人和大鼠劑量換算，治療組每日藥物灌胃1mL/100 g，對(duì)照組不做處理。2周后腹主動(dòng)脈取血。全血20℃，3000 r/min，離心15min， 取血清，56℃、30min 水浴滅活，0．22μm 針式過(guò)濾器濾菌，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 原代細(xì)胞培養(yǎng) 對(duì)照組大鼠取胸主動(dòng)脈進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。貼壁法培養(yǎng)原代胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。3 d后可見(jiàn)較多圓形透亮細(xì)胞，5～6 d換液，可見(jiàn)組織塊周?chē)兴鬆罴?xì)胞爬出，此后換用10%FBS培養(yǎng)液，2～3 d換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)1周左右，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈“峰-谷”樣排列，待平滑肌細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶。

1．5 細(xì)胞傳代、純化及保存 當(dāng)培養(yǎng)瓶底部長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞后，可進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代時(shí)，將消化吹打形成的細(xì)胞懸液靜置15min，使部分成纖維細(xì)胞貼壁，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)培養(yǎng)瓶中，再次靜置、貼壁，重復(fù)上述步驟1～2次，幾次傳代后可獲較純的平滑肌細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞傳至第3代時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。裝入凍存管中，置4℃冰箱中2 h，-20℃冰箱中放置1 h，-80℃冰箱中長(zhǎng)期保存。

1．6 胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鑒定 細(xì)胞以1×106個(gè)/mL種于6孔板中，孔內(nèi)預(yù)先置入細(xì)胞培養(yǎng)用蓋玻片。待細(xì)胞長(zhǎng)置80%滿(mǎn)時(shí)，去培養(yǎng)液，加入固定液，作用15min，去固定液，加封閉液，置培養(yǎng)箱中封閉1 h。去封閉液，加洗滌液，洗滌 3遍，每次 15min。加入一抗（1∶1000稀釋?zhuān)?，培養(yǎng)箱中作用1 h，一抗為actin抗體。回收一抗，洗滌液洗滌3遍，避光加入二抗（1∶400稀釋?zhuān)?，培養(yǎng)箱中避光作用1 h，二抗為抗小鼠FITC?；厥斩?，加抗熒光猝滅封片液，置熒光顯微鏡下觀(guān)察、拍照。鏡下可見(jiàn)鮮綠色與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的肌絲。

1．7 四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）法檢測(cè)藥物血清對(duì)正常VSMCs的影響 分為5組：DMEM組 （空白對(duì)照組）、DMEM+N 組 （DMEM+10%正常血清）、DMEM+L組 （DMEM+10%低濃度藥物血清）、DMEM+M組（DMEM+10%中濃度藥物血清）、DMEM+H組（DMEM+10%高濃度藥物血清），每組設(shè)6個(gè)副孔。將細(xì)胞以1×104個(gè)/mL種于96孔板中，次日去培養(yǎng)液，加入DMEM培養(yǎng)24 h進(jìn)行細(xì)胞同步，將細(xì)胞周期同步于G0/G1期，按照分組加入藥物血清，分別于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，后去培養(yǎng)液加入5mg/mLMTT 10μL和DMEM 90μL，培養(yǎng)箱中反應(yīng)3～4 h。吸去MTT液，每孔加二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振蕩 15min，使結(jié)晶溶解，置酶標(biāo)儀，570 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值。

1．8 MTT法檢測(cè)藥物血清對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響 實(shí)驗(yàn)方法同正常血管平滑肌。分為5組：DMEM+P 組 （DMEN+PDGF-BB）、DMEM+P+N 組（DMEM+PDGF-BB+10%正 常 血 清 ）、DMEM+P+L 組（DMEM+PDGF-BB+10%低濃度藥物血清）、DMEM+P+M組 （DMEM+PDGF-BB+10%中濃度血清血清）、DMEM+P+H組 （DMEM+PDGF-BB+10%高濃度血清血清），每組設(shè) 6 個(gè)副孔。分別培養(yǎng) 24、48、72 h。570 nm波長(zhǎng)下測(cè)試OD值。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 原代平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀(guān)察 見(jiàn)圖1。原代培養(yǎng)中，組織塊貼壁后5～7 d，可見(jiàn)少量細(xì)胞自組織塊邊緣游出，未成功貼壁的組織塊則無(wú)細(xì)胞爬出。細(xì)胞漸向外生長(zhǎng)形成細(xì)胞簇，細(xì)胞形態(tài)多樣（梭形、多角形、星形或不規(guī)則形），大小不等。此后細(xì)胞呈放射性生長(zhǎng)，至培養(yǎng)2周左右局部成束的細(xì)胞平行排列，部分區(qū)域細(xì)胞多層重疊，部分區(qū)域高低起伏呈“峰-谷”狀生長(zhǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)可進(jìn)行傳代，90%以上細(xì)胞可重新貼壁，生長(zhǎng)方式及形態(tài)特點(diǎn)同前。

圖1 第3代大鼠VSMC

圖2 VSMCα-actin肌動(dòng)蛋白免疫熒光染色

2．2 VSMCs組織學(xué)鑒定 見(jiàn)圖2。待VSMCs傳至第3代，可進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光鑒定。透過(guò)熒光顯微鏡，可見(jiàn)VSMCs肌絲呈鮮綠色，與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行排列，表示α肌動(dòng)蛋白呈陽(yáng)性表現(xiàn)。

2.3 丹蔞片對(duì)正常VSMCs增殖活性的影響 見(jiàn)表1。與DMEM比較，各組VSMCs在不同培養(yǎng)時(shí)間都有非常顯著增殖（P＜0.01）。不同濃度藥物血清組與正常血清組相比，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。不同濃度藥物血清組之間比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表1 丹蔞片對(duì)正常平滑肌細(xì)胞增殖抑制作用OD值比較（±s）

表1 丹蔞片對(duì)正常平滑肌細(xì)胞增殖抑制作用OD值比較（±s）

與DMEM組同時(shí)間比較，**P＜0.01；與DMEM+L組同時(shí)間比較，#P＜0.01。

組別 n 72 h DMEM 組 6 0.656±0.170 DMEM+N 組 6 2.124±0.290**DMEM+L 組 6 1.839±0.136**24 h 48 h 0.647±0.071 0.552±0.077 1.600±0.102**1.756±0.027**1.545±0.067**1.802±0.046**DMEM+M 組 6 2.128±0.155**#1.597±0.044**1.732±0.077**DMEM+H 組 6 1.642±0.071**1.797±0.101**2.272±0.302**#

2.4 丹蔞片對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs增殖活性的影響 如表2。與DMEM+P相比，各組均有非常顯著差異（P＜0.01）。與正常血清組相比較，24 h低、中濃度血清組與72h各濃度血清組均有差異（P＜0.05）；24 h高濃度血清組與48 h各濃度血清組均有極顯著差異（P＜0.01）。與低濃度血清組比較，48 h高濃度血清組有顯著差異（P＜0.05），24 h高濃度血清組有非常顯著差異（P＜0.01）。

表2 丹蔞片對(duì)PDGF-BB刺激下平滑肌細(xì)胞增殖抑制OD 值比較（±s）

表2 丹蔞片對(duì)PDGF-BB刺激下平滑肌細(xì)胞增殖抑制OD 值比較（±s）

與DMEM+P組同時(shí)間比較比較，**P＜0.01；與DMEM+P+N組同時(shí)間比較，#P＜0.05；與 DMEM+P+N 組同時(shí)間比較，△P＜0.01；與 DMEM+P+L 組同時(shí)間比較，▲P＜0.01；與 DMEM+P+L 組同時(shí)間比較，□P＜0.05。

組 別 n 72 h DMEM+P 組 6 1.670±0.158 DMEM+P+N 組 6 3.723±0.179**DMEM+P+L 組 6 3.539±0.078**#24 h 48 h 1.097±0.183 1.625±0.092 1.865±0.048** 2.855±0.079**1.780±0.056**# 2.695±0.085**△DMEM+P+M組 6 3.487±0.145**#1.747±0.098**# 2.658±0.052**△DMEM+P+H 組 6 1.685±0.037**△▲ 2.594±0.050**△□ 3.481±0.168**#

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)選用PDGF-BB作為誘導(dǎo)平滑肌增殖誘導(dǎo)劑。PDGF-BB是一種強(qiáng)烈的細(xì)胞絲裂原，可通過(guò)激活多條信號(hào)通路而調(diào)節(jié)功能蛋白的磷酸化狀態(tài)和相互作用關(guān)系，最終抑制或激活靶基因的表達(dá)［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)PDGF-BB通過(guò)誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化致使在不同濃度的PDGF-BB刺激下VSMC活力呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性提高，在PDGF-BB影響下，處于G0/G1期VSMC細(xì)胞明顯減少［3］。

AS是多種因素相互作用的復(fù)雜過(guò)程［4］。典型AS病變多發(fā)生在大動(dòng)脈和中動(dòng)脈，在包括脂質(zhì)等多種因素的作用下，VSMC可由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停?］。合成型的VSMC較收縮型細(xì)胞更易于遷移、增殖［6］。在A(yíng)S晚期，VSMC在炎癥因子作用下，表型發(fā)生改變，增殖并向內(nèi)膜下遷移，吞噬ox-LDL成為泡沫細(xì)胞。壞死泡沫細(xì)胞及組織碎片形成病變深部糜粥樣柔軟部分，突出于管腔表面，覆以較堅(jiān)硬的纖維被膜。硬化斑塊的纖維帽結(jié)構(gòu)的發(fā)生發(fā)展主要是VSMC的遷徙、增殖及基質(zhì)的沉積，導(dǎo)致動(dòng)脈管腔的狹窄。不穩(wěn)定斑塊發(fā)生破裂，可造成血栓而導(dǎo)致嚴(yán)重不良后果。本實(shí)驗(yàn)將血管平滑肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，從一定程度上改善動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常血清組比較，丹蔞片各濃度藥物血清組培養(yǎng)24、48、72 h OD值均有降低，提示丹蔞片藥物血清可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖。

丹蔞片組方立足于痰瘀同治理論，全方由瓜蔞皮清熱化痰、利氣寬胸，薤白通陽(yáng)散結(jié)，二者相合，化痰散結(jié)，行氣導(dǎo)滯，共為君藥。臣以丹參活血涼血、赤芍清熱涼血、川芎活血行氣、葛根益胃生津，共奏活血化瘀、通絡(luò)止痛之功。佐以黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)、澤瀉利水滲濕，以郁金活血行氣、開(kāi)郁止痛，骨碎補(bǔ)活血補(bǔ)腎為使。全方化痰散結(jié)，補(bǔ)氣活血，補(bǔ)而不滯，伐而不過(guò)。藥理研究發(fā)現(xiàn)，瓜蔞可擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈增加血流量，提高耐缺氧能力，降低血清膽同醇，抗菌、抗癌等多種作用［7］。丹參中包含丹參酮類(lèi)、丹參酚酸類(lèi)，對(duì)循環(huán)系統(tǒng)也有擴(kuò)冠、增加血流、減少氧耗的作用［8］。在既往實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究的基礎(chǔ)上，證實(shí)丹蔞片具有抑制VSMC增殖的作用，為丹蔞片抗AS提供了新的證據(jù)。

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