益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇脚c性激素對(duì)NOD小鼠的整體療效及免疫功能的干預(yù)作用*

黃綏心 王新昌 肖麗群 吳啟富 范永升

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州310005；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515）

干燥綜合征（SS）是一種臨床較為常見(jiàn)的自身免疫性疾病。益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇绞且罁?jù)SS氣虛陰虧的主要病機(jī)特點(diǎn)組方而成，前期的研究表明，該方具有較好的臨床療效［1］。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，采用益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇胶托约に刂委煼欠逝痔悄虿∽园l(fā)性SS模型小鼠?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 8周齡雌性非肥胖糖尿?。∟OD）小鼠60只，ICR 小鼠 10 只，體質(zhì)量（20.0±2.0）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。NOD小鼠動(dòng)物合格證號(hào) SCXK （滬）2007-0005；ICR小鼠動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）2008-0016。

1.2 儀器和試劑 動(dòng)物電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，型號(hào)TC3KH）；精密電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，型號(hào)BS124S）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA檢測(cè)試劑盒 （上海西唐生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1207261）；小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海西唐生物技術(shù)有限公司，批號(hào)1207251）。

1.3 藥物 益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇浇M成：生地黃24 g，玄參15 g，麥冬 15 g，石斛 12 g，白芍 12 g，黃芪 24 g，丹參30 g，益母草15 g。以上藥材購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠；脫氫表雄酮（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)D4000）；戊酸雌二醇（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)035A）；硫酸羥氯喹片（上海中西制藥有限公司，批號(hào)101106）。

1.4 分組與給藥 NOD小鼠60只，ICR小鼠10只，先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后NOD小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：模型組、羥氯喹組、益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇浇M（中藥組）、脫氫表雄酮（DHEA）組、雌二醇（E2）組、脫氫表雄酮加雌二醇（DHEA+E2）組，每組10只。10只ICR小鼠為正常組。正常組和模型組給生理鹽水灌胃，羥氯喹組給予羥氯喹藥液75mg/kg，中藥組給予益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇剿幰?7.4 g/kg；DHEA組給予脫氫表雄酮混懸液37.5mg/kg；E2組給予雌二醇溶液 0.375mg/kg；DHEA+E2組給予DHEA 37.5mg/kg，E20.375mg/kg。 所有實(shí)驗(yàn)小鼠均以0.2mL/10 g灌胃12周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) （1）飲水量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第1日起，每日給藥前稱重并記錄各組小鼠飲水瓶質(zhì)量，計(jì)算各組小鼠日均飲水量。分別在第9周末、第15周末和第20周末統(tǒng)計(jì)結(jié)果。計(jì)算公式：小鼠日均飲水量（g）=［前1 日全組飲水瓶質(zhì)量（g）-當(dāng)日全組飲水瓶質(zhì)量（g）］/全組動(dòng)物數(shù)。（2）唾液分泌量測(cè)定。分別在NOD小鼠第9、15和20周齡時(shí)用濕重法測(cè)各組小鼠唾液分泌量。具體方法：撿取干棉球1個(gè)，稱其干質(zhì)量為M0，質(zhì)量在4.5～5.0mg范圍。然后將棉球置于小鼠口頰內(nèi)，并用鑷子將其固定，5min后取出，在電子天平上稱其濕質(zhì)量M，（M-M0）即為小鼠唾液分泌量。（3）胸腺、脾臟和頜下腺指數(shù)測(cè)定。灌胃飼養(yǎng)12周后，小鼠取血后并斷頸處死，分離脾臟、胸腺和頜下腺并精確稱質(zhì)量，計(jì)算小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。（4）小鼠血清細(xì)胞因子檢測(cè)。小鼠取血后，將血漿置于室溫中30min以上，以3000 r/min離心15min，分離血清，凍存于-80℃超低溫冰箱。采用ELISA法測(cè)定血清中TNF-α、IL-6，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀取樣本含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s）表示，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠每日飲水量比較 見(jiàn)表1。第9周末，NOD各組小鼠每日飲水量相近（P＞0.05），但高于正常組（P＜0.05）。第15周末時(shí)，除中藥組外，各給藥組飲水量均較模型組和同組第9周末時(shí)減少（P＜0.05）；DHEA組比羥氯喹組、E2組和DHEA+E2組更低 （P＜0.05）；且與正常組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。第 20周末時(shí)，各給藥組飲水量均較第15周末時(shí)進(jìn)一步減少（P＜0.05）；與正常組比較，羥氯喹組、E2組和 DHEA+E2組的飲水量仍偏高（P＜0.05）。9周齡時(shí)，與正常組比較，中藥組小鼠每日飲水量更高（P＜0.05）。15周齡時(shí)，中藥組每日飲水量較模型組和9周齡時(shí)明顯減少（P＜0.05），與正常組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。 20周齡時(shí)，中藥組飲水量較第15周末時(shí)略有減少，且明顯低于羥氯喹組（P＜0.05）。

表1 各組小鼠每日飲水量比較（g，±s）

表1 各組小鼠每日飲水量比較（g，±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與 DHEA組比較，★P＜0.05；與本組 9 周齡比較，■P＜0.05。 下同。

第9周末 第15周末4.21±0.32 4.26±0.24△6.38±0.44*6.55±0.43*6.63±0.40* 5.07±0.62*△★■DHEA 組 10 4.25±0.63△■組 別 n 第20周末正常組 10 4.18±0.35△模型組 10 6.72±0.68*羥氯喹組 10 4.96±0.57*△★■6.56±0.60* 4.35±0.55△■E2組 10 6.53±0.46* 5.18±0.53*△★■ 4.98±0.58*△★■DHEA+E2組 10 6.57±0.58* 5.03±0.61*△★■ 4.91±0.49*△★■中藥組 10 6.61±0.53* 4.69±0.58△■ 4.32±0.55△■

2.2 各組小鼠唾液分泌量比較 見(jiàn)表2。與正常組比較，模型組小鼠唾液分泌量明顯減少（P＜0.05）。第9周末時(shí)，NOD各組唾液分泌量相近（P＞0.05），且明顯低于正常組（P＜0.05）。第15周末時(shí)，各給藥組唾液分泌量比模型組明顯增加（P＜0.05）；DHEA組唾液分泌量更高于羥氯喹組、E2組和本組第9周末（P＜0.05）。第20周末時(shí)，各給藥組小鼠唾液分泌量較15周末時(shí)稍有減少，但仍比模型組分泌量高（P＜0.05）；羥氯喹組、E2組、DHEA+E2組與同組 9 周末相近 （P＞0.05），與DHEA組比較，DHEA+E2組分泌量與其有顯著差異（P＜0.05）。

表2 各組小鼠唾液分泌量比較（mg，±s）

表2 各組小鼠唾液分泌量比較（mg，±s）

第9周末 第15周末6.60±0.36△ 6.79±0.28△4.05±0.33*3.72±0.36*4.13±0.40* 4.54±0.33*△★DHEA 組 10 5.58±0.29*△■組 別 n 第20周末正常組 10 6.69±0.32模型組 10 3.71±0.18*羥氯喹組 10 4.49±0.37*△★4.06±0.30* 5.78±0.23*△■E2組 10 4.13±0.36* 4.52±0.26*△★ 4.47±0.25*△★DHEA+E2組 10 4.07±0.28*4.91±0.39*△ 4.77±0.38*△★中藥組 10 4.11±0.33* 5.70±0.33*△■ 5.63±0.31*△■

9周齡時(shí)，中藥組小鼠唾液分泌量低于正常組（P＜0.05）。15周齡時(shí)，中藥組唾液分泌量較9周末時(shí)增加明顯，并顯著高于模型組（P＜0.05）；與羥氯喹組比較，中藥組唾液分泌量更高（P＜0.05）。20周齡時(shí)，中藥組唾液分泌量較15周末時(shí)略有減少，但仍高于模型組與羥氯喹組（P＜0.05）。

2.3 各組小鼠胸腺、脾臟和頜下腺指數(shù)比較 見(jiàn)表3。與正常組比較，各組小鼠脾臟指數(shù)均升高（P＜0.05）；與模型組比較，羥氯喹組、DHEA組、中藥組明顯低于模型組（P＜0.05）；E2組、DHEA+E2組雖低于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，NOD各組胸腺指數(shù)均降低 （P＜0.05），與模型組比較，DHEA組胸腺指數(shù)增高明顯 （P＜0.05）；而羥氯喹組、E2組、DHEA+E2組與模型組相近（P＞0.05）。與正常組比較，NOD各組小鼠頜下腺指數(shù)均降低，其中羥氯喹組、E2組和DHEA+E2組更低 （P＜0.05）；DHEA組與正常組相近（P＞0.05），且高于模型組、羥氯喹組和 E2組（P＜0.05）。與正常組比較，中藥組胸腺指數(shù)仍偏低 （P＜0.05），但高于模型組和羥氯喹組（P＜0.05）。中藥組小鼠頜下腺指數(shù)與正常組相近（P＞0.05），但顯著高于羥氯喹組（P＜0.05）。

表3 各組小鼠胸腺、脾臟和頜下腺指數(shù)比較（mg/g，±s）

表3 各組小鼠胸腺、脾臟和頜下腺指數(shù)比較（mg/g，±s）

脾臟指數(shù) 胸腺指數(shù)3.02±0.34△ 1.68±0.15△4.08±0.29* 1.06±0.11*3.46±0.38△ 1.21±0.19*DHEA 組 10 0.69±0.13△★■組 別 n 頜下腺指數(shù)正常組 10 0.77±0.21△模型組 10 0.40±0.05*羥氯喹組 10 0.44±0.06*3.44±0.24△ 1.52±0.12△E2組 10 3.91±0.37* 1.22±0.11* 0.49±0.08*DHEA+E2組 10 3.83±0.20* 1.26±0.12* 0.53±0.10*中藥組 10 3.52±0.45 1.45±0.15 0.66±0.08

2.4 各組小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 見(jiàn)表4。NOD各組小鼠血清TNF-α、IL-6水平均明顯高于正常組（P＜0.05）；與模型組比較，羥氯喹組、DHEA 組和DHEA+E2組 TNF-α、IL-6 水平均降低明顯（P＜0.05）。中藥組小鼠血清TNF-α、IL-6水平較模型組明顯下降（P＜0.05），比羥氯喹組降低更為明顯（P＜0.05）；與正常組比較，中藥組血清TNF-α、IL-6水平仍偏高（P＜0.05）。

表 4 各組小鼠血清 TNF-α、IL-6 水平比較（mg/g，±s）

表 4 各組小鼠血清 TNF-α、IL-6 水平比較（mg/g，±s）

TNF-α IL-6 107.07±16.22△ 15.56±1.52△296.54±22.68* 34.62±6.42*230.95±17.98△ 25.59±3.15*DHEA 組 10 238.53±15.13△ 25.58±3.40△E2組 10 269.87±18.26* 29.47±4.16*DHEA+E2組 10 244.38±16.28* 27.83±5.65*中藥組 10 193.61±12.32* 21.32±4.09*組 別 n正常組 10模型組 10羥氯喹組 10

3 討 論

SS患者臨床上常因涎腺和淚腺功能下降而出現(xiàn)口干、眼干癥狀，并伴有多器官、多系統(tǒng)的損害［2］；其免疫病理本質(zhì)是在遺傳缺陷的基礎(chǔ)上，局部非特異性感染導(dǎo)致局部和全身的免疫反應(yīng)，進(jìn)一步引發(fā)免疫機(jī)制的紊亂、炎癥遷延，最終使得唾液腺、淚腺等外分泌腺受損，大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，腺管狹窄、萎縮和纖維化，從而導(dǎo)致唾液、淚液分泌減少出現(xiàn)口干渴、眼干癥狀［3］。

本研究采用的NOD小鼠是近年來(lái)實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用較多的動(dòng)物模型，其表現(xiàn)與人類SS相似，是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究SS 較為理想的模型［4-7］。

目前對(duì)SS尚無(wú)根治的療法，臨床主要應(yīng)用的免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期使用副作用較多。中醫(yī)認(rèn)為本病為先天稟賦不足，素體五臟羸弱，致氣血不足而發(fā)?。幌忍礻幘澨?，津液生成減少，臟腑經(jīng)絡(luò)、筋骨百骸、四肢孔竅無(wú)以濡養(yǎng)而燥癥外現(xiàn)。故本病辨證為氣虛陰虧兼夾血瘀為本，燥熱為標(biāo)，治療總則為益氣養(yǎng)陰?kù)铕?。依此以黃芪、生地黃、玄參、麥冬、石斛、白芍、丹參、益母草等制方進(jìn)行治療。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為性激素在SS的發(fā)生、發(fā)展中應(yīng)該起著重要作用，但調(diào)控機(jī)制和途徑尚未能有明確的闡釋［8］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［9］，益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇綄?duì)SS患者外周血雌、雄激素水平有較好的調(diào)整作用。

本研究應(yīng)用益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇胶托约に刂委烴OD小鼠，從飲水量、唾液分泌量、胸腺、脾臟和頜下腺指數(shù)以及血清細(xì)胞因子等方面觀察治療作用，結(jié)果顯示，益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇胶虳HEA可通過(guò)改善頜下腺的病理狀態(tài)而緩解口干癥狀；DHEA提高唾液分泌量、改善口干的作用明顯。

脾臟和胸腺均是機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官。通過(guò)檢測(cè)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)可以評(píng)價(jià)免疫器官的形態(tài)發(fā)育和免疫功能的狀態(tài)。益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇胶虳HEA能改善脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，抑制腺體萎縮，而達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。

研究已證實(shí)，SS外分泌腺的損害與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及其中的細(xì)胞因子水平關(guān)系密切。由于多數(shù)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞，因此T細(xì)胞被視為SS外分泌腺受損的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NOD小鼠血清Th1型細(xì)胞因子TNF-α和Th2型細(xì)胞因子IL-6水平均較正常組明顯增高，表明NOD小鼠存在高水平的Th1、Th2型細(xì)胞因子。應(yīng)用益氣養(yǎng)陰?kù)铕鲋兴幒虳HEA后，小鼠血清TNF-α、IL-6水平較模型組降低，表明益氣養(yǎng)陰?kù)铕鲋兴幒虳HEA能降低血清TNF-α、IL-6水平，調(diào)節(jié)NOD小鼠免疫功能。

益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇胶虳HEA對(duì)NOD小鼠均有良好的療效及改善免疫功能的作用，表明益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇骄哂蓄愋奂に貥拥闹委熥饔?。E2的治療作用在本研究中未得到體現(xiàn)，可能是與實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容側(cè)重于對(duì)唾液腺治療觀察有關(guān)，因此益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇脚cE2在治療方面的比較是需要今后進(jìn)一步探討的問(wèn)題。另外，筆者發(fā)現(xiàn)DHEA在合用E2后，其治療作用均較單用DHEA療效降低，原因是雄雌激素用藥比例的問(wèn)題抑或是存在不同的信號(hào)途徑，其確切機(jī)理尚待深入研究。

［1］ 王新昌，謝志軍，溫成平，等.益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇ㄖ委熢l(fā)性SS 的療效觀察［J］.中國(guó)基層醫(yī)藥，2009，16（1）：92-95.

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