斑馬魚模型在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用※

邢學(xué)鋒 馬欽海 徐成賀 許文學(xué)

（南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥藥劑實(shí)驗(yàn)室，廣州 510515）

近年來，隨著中醫(yī)藥事業(yè)的迅猛發(fā)展，國內(nèi)外對(duì)中藥的研究也不斷的深入。中藥是多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜體系，其藥效物質(zhì)是其發(fā)揮臨床治療作用的基礎(chǔ)，中藥藥效篩選和評(píng)價(jià)的新技術(shù)和新方法的引進(jìn)已成為中醫(yī)藥學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)。目前，模式生物斑馬魚的使用正逐漸拓展到生命體多個(gè)系統(tǒng)，并已應(yīng)用于小分子化合物的大規(guī)模新藥篩選。這對(duì)中藥有效成分的篩選、作用機(jī)制的闡明、體內(nèi)代謝的過程等具有巨大的促進(jìn)作用。總結(jié)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，目前斑馬魚在中藥中的應(yīng)用主要集中在中藥代謝研究、毒理研究和重大疾病中藥成分活性篩選等幾方面，本文將就斑馬魚在篩選模型、現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)中藥研究相結(jié)合的新型模式等應(yīng)用情況進(jìn)行探討，以期有益于中醫(yī)藥事業(yè)現(xiàn)代研究的發(fā)展。

1 斑馬魚的生物學(xué)特性

斑馬魚 (zebrafish)又名藍(lán)條魚、花條魚，是輻鰭亞綱 (Actinopterygii)鯉科 (Cyprinidae)短擔(dān)尼魚屬(Danio)的一種熱帶淡水魚[1]。斑馬魚繁殖能力強(qiáng)，胚胎發(fā)育迅速，幼魚體長非常小，作為藥物篩選模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：篩選周期短、準(zhǔn)確率高，胚胎透明、容易觀察，樣品用量少、用藥簡單、活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，與人類有高度相關(guān)性等優(yōu)點(diǎn)，因而利用斑馬魚模型篩選出的成分其活性相對(duì)比較準(zhǔn)確。

另外，此模型克服了只能觀察化合物對(duì)某一特定生理過程的效果，無法從整體水平直觀地評(píng)估藥物的治療作用、毒性作用、不良反應(yīng)等體外細(xì)胞和化學(xué)篩選模型的缺點(diǎn)?；铙w動(dòng)物的整體器官與表型篩選可觀察化合物對(duì)復(fù)雜生命過程的影響[2]。

2 斑馬魚在中藥毒理學(xué)方面的研究

從20世紀(jì)70年代末期，國外開始運(yùn)用斑馬魚進(jìn)行化合物的毒性、毒理研究[3]，斑馬魚現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛地用于環(huán)境、藥物、病理等毒理學(xué)領(lǐng)域的研究中，并顯現(xiàn)出很多獨(dú)特的優(yōu)勢[4]，目前其在藥物早期毒性篩選方面最主要是運(yùn)用在胚胎發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、心臟毒性等方面的研究，且斑馬魚具有重復(fù)性好、預(yù)測性高等的體內(nèi)篩選藥物毒性的模式動(dòng)物的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，使其在新藥研發(fā)方面具有重要價(jià)值，而在中藥毒性篩選方面，主要集中在斑馬魚的胚胎、心臟的毒性影響的研究。

通過對(duì)研究不同中藥，如飛機(jī)草[5]，雷公藤[6]，兩面針[7-8]，莪術(shù)[9]、甘遂[10]秋水仙堿[11]等對(duì)斑馬魚胚胎心臟毒性、腦毒性等方面的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的藥物對(duì)其影響是不同的，且都呈現(xiàn)一定的毒性反應(yīng)。

通過比較麻黃湯、小柴胡湯、葛根芩連湯這三個(gè)經(jīng)典方劑的超微飲片與傳統(tǒng)飲片水煎液對(duì)斑馬魚胚胎毒性的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)超微中藥飲片毒性大于傳統(tǒng)中藥飲片，為超微飲片臨床用藥安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[12]。

Pyun等[13]通過綠茶中微量成分表兒茶精對(duì)斑馬魚因抑制活性氧防止輻射誘發(fā)聽細(xì)胞死亡作用的研究。結(jié)果表明：表兒茶精對(duì)輻射誘發(fā)的胚胎毒性有明顯減弱作用，并能防止輻射誘發(fā)的神經(jīng)丘毛細(xì)胞減少，將其作為防治輻射誘發(fā)耳毒性的安全有效候選藥物。

通過以上在中藥毒性的胚胎、心臟毒性的研究中對(duì)斑馬魚模型的應(yīng)用和前人通過斑馬魚模型對(duì)藥物毒性篩選的研究，充分顯示了斑馬魚模型在其他毒性方面的運(yùn)用也有很大的空間，如心血管毒性、行為毒性等方面，但是運(yùn)用斑馬魚對(duì)中藥毒性研究報(bào)道還很少。另外，由于斑馬魚與人和其他的哺乳動(dòng)物存在一定的差異，且中藥是一個(gè)復(fù)雜的、多靶點(diǎn)的體系，與化學(xué)藥物單一成分的研究有很大的不同，所以運(yùn)用斑馬魚模型在其他方面的毒性中藥的篩選的可靠性和適用性都還需要進(jìn)一步的研究評(píng)價(jià)。

3 斑馬魚在中藥活性篩選和評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

隨著高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，雖然可以通過體外篩選來獲得包括中藥成分在內(nèi)的大量活性化合物，但由于很多中藥成分的復(fù)雜性，往往存在吸收、分布、代謝、排泄及毒性等方面的問題。所以，對(duì)這些活性化合物進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)鑒定非常必要。目前，用于藥物篩選的動(dòng)物模型有很多，但存在各種不足因素，而由于斑馬魚的基因、遺傳等方面有高度的相似性，在藥物篩選方面具有巨大的潛能。利用基因突變的方法，建立各種斑馬魚疾病模型[14]，產(chǎn)生與斑馬魚突變系具有與人類疾病相似的癥狀，這對(duì)新藥篩選和內(nèi)臟特異性毒理學(xué)研究起著至關(guān)重要的作用。

3.1 斑馬魚模型在中藥調(diào)節(jié)血管新生研究中的應(yīng)用 在許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，伴隨著機(jī)體對(duì)血管新生的調(diào)控失衡，特別是在腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的影響尤為突出。由于斑馬魚的胚胎發(fā)育透明，早期血管生成模式較簡單等特點(diǎn)和中藥本身的特點(diǎn)，斑馬魚整體器官模型在血管新生藥物的篩選方面起到重要的作用，更加適合于中藥活性成分的篩選[15]。

ZhaoH等人[16]利用斑馬魚的血管損傷模型發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸提取物水溶性成分SBD-4，能有效的復(fù)原斑馬魚的血管。此次發(fā)現(xiàn)也說明了通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚篩選而發(fā)現(xiàn)的具有促血管新生活性的當(dāng)歸提取物可作為治療血管新生不足類疾病潛在的藥物而改善人類的生活。

通過對(duì)地黃水提取物的不同溶劑萃取部位進(jìn)行了活性篩選，采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚 [TG (fli1：EGFP)y1/+(AB)]胚胎血管生成模型，并對(duì)活性部位主要化學(xué)成分進(jìn)行了血管藥效學(xué)研究。發(fā)現(xiàn)地黃水粗提取物可增加斑馬魚腸下靜脈毛細(xì)血管形成數(shù)量，且有促進(jìn)血管生成的作用[17]。

3.2 斑馬魚模型在中藥對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)方面的應(yīng)用 具有神經(jīng)活性的小分子是治療精神類疾病的主要藥物來源，但這類藥物存在較難發(fā)現(xiàn)與鑒定等方面的難題。而利用斑馬魚可有效篩選影響生物體復(fù)雜功能行為并治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。目前，在運(yùn)用斑馬魚于中藥對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)方面的研究主要集中在對(duì)學(xué)習(xí)記憶、血腦屏障和一些相關(guān)性疾病方面的研究。

3.2 .1 斑馬魚在學(xué)習(xí)與記憶研究中的應(yīng)用 在學(xué)習(xí)與記憶研究中，斑馬魚具有兩個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)，一是利用斑馬魚幼魚的透光性，運(yùn)用注射熒光染料或者轉(zhuǎn)基因的方法，我們可以通過成像實(shí)時(shí)觀察神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)。其二是可以記錄清醒斑馬魚上的在體電生理神經(jīng)元的電活動(dòng)。

通過對(duì)東莨菪堿致記憶障礙斑馬魚模型的防治作用的中藥研究，發(fā)現(xiàn)槲皮素和蘆丁藥物都可預(yù)防由東莨菪堿導(dǎo)致的記憶障礙，而且不影響魚體的正常運(yùn)動(dòng)，并提出槲皮素和蘆丁等藥物成分可以作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病 (如阿爾茨海默癥)的治療藥物[18]。

通過對(duì)一些中藥進(jìn)行斑馬魚免疫染色和行為學(xué)試驗(yàn)篩選，Zhang ZJ等人[19-20]篩選到益智仁提取物 (AOE)和谷精草提取物 (EB)的神經(jīng)保護(hù)作用。AOE乙醇提取物可以預(yù)防和恢復(fù)6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元退化，對(duì)斑馬魚的游泳行為缺陷具有改善作用。EB可以恢復(fù)多巴胺神經(jīng)元的損傷，延長6-OHDA模型斑馬魚的運(yùn)動(dòng)距離，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并劑量依賴性作用。

3.2 .2 斑馬魚在一些神經(jīng)疾病方面的研究 利用斑馬魚藥物依賴模型對(duì)鉤藤提取物進(jìn)行研究，結(jié)果表明鉤藤提取物對(duì)甲基苯丙胺等神經(jīng)依賴性藥物具有治療干預(yù)作用[21]。根據(jù)斑馬魚的生理學(xué)特性和現(xiàn)在對(duì)抗焦慮模型的對(duì)比，方芳[22]等提出運(yùn)用新魚缸潛水實(shí)驗(yàn)和報(bào)警信息素兩種途徑建造模型來篩選中藥的抗焦慮療效，并提出了其優(yōu)越性，為篩選抗焦慮中藥提供了依據(jù)。此外，斑馬魚模型在中藥治療憂郁癥、睡眠紊亂等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的篩選也有相關(guān)的研究。

3.3 斑馬魚在抗骨質(zhì)硫松中藥活性成分篩選的應(yīng)用由于斑馬魚和人類在骨骼發(fā)育過程中的基因、信號(hào)通路有高度同源性，而且其幼魚透明的身體使得能在活體的狀況下對(duì)斑馬魚體內(nèi)的骨架形成及發(fā)育進(jìn)行觀察，并可以使用染料對(duì)骨架進(jìn)行染色，能進(jìn)一步對(duì)骨骼的大小和骨密度進(jìn)行定量化。而由于斑馬魚的生理特性和中藥的多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，采用斑馬魚建立壯骨效應(yīng)評(píng)價(jià)新模型，有望成為體現(xiàn)中藥整體觀的，兼具體優(yōu)勢、靈敏、高效地評(píng)價(jià)中藥抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)的目標(biāo)。

王娟[23]等研究淫羊藿苷對(duì)牙齒鈣磷沉積的影響，結(jié)果表明淫羊藿苷對(duì)牙齒發(fā)育中的鈣磷沉積有一定的影響，這對(duì)于在臨床上齲病的防治有良好的指導(dǎo)意義。為進(jìn)一步明確將斑馬魚作為牙齒發(fā)生發(fā)育分子生物學(xué)研究模型的可行性和先進(jìn)性；研究牙齒發(fā)育的重要信號(hào)因子 （Pax9基因、Pitx2基因）在牙發(fā)生發(fā)育過程中的作用機(jī)制及作用途徑和淫羊藿苷對(duì)牙齒生長發(fā)育的影響，李瑾等[24]對(duì)斑馬魚的組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)及斑馬魚背腹軸形成和骨化相關(guān)基因的研究。

3.4 斑馬魚在中醫(yī)針灸經(jīng)絡(luò)研究中的應(yīng)用 在中醫(yī)研究中，經(jīng)絡(luò)和穴位的研究一直是個(gè)難點(diǎn)，也是眾多中醫(yī)藥研究者研究的熱點(diǎn)，穴位主要功能是感覺，針刺穴位所產(chǎn)生的酸麻脹痛熱等針效均表現(xiàn)為感覺器官的反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，感覺器官在軀體的有規(guī)律的集中分布在功能上類似于穴位。中醫(yī)對(duì)經(jīng)絡(luò)的經(jīng)典描述與研究所觀察到的感覺器官所形成的線類似，都形成若干條線。因此，有研究者推測斑馬魚存在類穴位與類經(jīng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；斑馬魚皮膚感覺器官并不是均勻地分布于全身，而是若干感覺器官聚集在一起形成有規(guī)律的簇，而若干簇又有規(guī)律地沿軀體長軸排成線，類似于傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)與穴位[25]。這一研究對(duì)中醫(yī)的經(jīng)絡(luò)學(xué)說的繼續(xù)發(fā)展具有有力的推動(dòng)作用，并對(duì)中藥與針灸學(xué)相結(jié)合的穴位給藥提供了強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

4 斑馬魚模型在中藥藥物代謝研究中的應(yīng)用

近年來，對(duì)中藥藥物代謝的研究主要借助于化學(xué)藥物代謝的基本理論和方法，通過對(duì)藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝等過程的變化，并用動(dòng)力學(xué)原理闡明動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律。斑馬魚作為研究體內(nèi)藥物代謝的平臺(tái)已逐漸引起中醫(yī)藥學(xué)者關(guān)注。

Li ZH等[26]首次利用蛋白質(zhì)組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法檢測到斑馬魚與哺乳動(dòng)物的代謝酶體系極度相似性，從而構(gòu)建了斑馬魚研究中藥及其單體藥物代謝的平臺(tái)。他們還用多種方法：包括蛋白組學(xué)等研究手段，對(duì)淫羊藿黃酮類化合物如淫羊藿素、淫羊藿苷和朝藿定C在斑馬魚體內(nèi)分布和代謝機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果闡述了淫羊藿黃素及其衍生物在斑馬魚整體模型中的代謝途徑、分布機(jī)制，為斑馬魚成為一種實(shí)用的體內(nèi)代謝篩選模型提供了理論依據(jù)[27]。Hu G等人[28]通過LC-MS/MS方法，鑒定分析毛蕊異黃酮在斑馬魚幼魚中吸收和代謝的產(chǎn)物，表明毛蕊異黃酮可能的代謝途徑有葡萄糖醛酸化、糖基化、硫酸化、氧化或上述兩種代謝過程。

5 展望

斑馬魚由于其發(fā)育快、胚胎期透明以及可用于大批量的快速篩選等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛用于胚胎分子發(fā)育與疾病模型的構(gòu)建，以及藥物篩選等研究的模式生物，且逐漸成為開展中醫(yī)藥研究的一個(gè)重要的體內(nèi)模型。目前斑馬魚應(yīng)用于中醫(yī)藥的研究還處于探索階段，并主要集中在中藥成分組分的研究應(yīng)用、藥效成分的篩選上。但根據(jù)已取得研究結(jié)果可以肯定，斑馬魚在解決中藥復(fù)方研究中的幾個(gè)關(guān)鍵問題——是否有效、為什么有效、什么成分有效上均可發(fā)揮重要作用。因此，結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論、臨床實(shí)踐及現(xiàn)代研究進(jìn)展，應(yīng)用斑馬魚生物模式開展藥效學(xué)、藥物代謝學(xué)及毒理學(xué)等全方面多角度的中藥研究前景較為理想。隨著斑馬魚轉(zhuǎn)基因模型的發(fā)展以及更多的斑馬魚疾病模型的建立，將會(huì)為今后中醫(yī)藥國際化提供更多全面而又便利的科研平臺(tái)和更為科學(xué)的理論依據(jù)，也將為中醫(yī)藥現(xiàn)代化的進(jìn)程提供新興的動(dòng)力。

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