Osterix在調(diào)控脊椎松質(zhì)骨骨量中的作用*

宗兆文,陳思旭,賈 敏,華 祥,郭慶山,沈 岳,趙玉峰,劉道城,Jerry Feng

(1.第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷/燒傷與復合傷國家重點實驗室創(chuàng)傷科，重慶 400042；2.德克薩斯州衛(wèi)生科學中心Baylor醫(yī)學院生物醫(yī)學系，美國德克薩斯州達拉斯75246)

骨質(zhì)疏松是一種以骨量低下、骨微結構破壞為特點，進而導致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[1]。骨質(zhì)疏松不僅威脅中老年人的健康，也給家庭和社會帶來的沉重的經(jīng)濟負擔。骨質(zhì)疏松被認為是一個多因素疾病，但其具體發(fā)病機制尚不明了，導致其防治效果不佳[2-3]。Osterix是重要的成骨相關轉錄因子，被證實在成骨細胞的成熟和向骨細胞的終末分化中起到重要作用[4-6]。本研究通過轉基因和基因敲除的方法觀察Osterix在調(diào)控脊椎骨量中的作用，并探索其可能機制，以期為探索骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制提供一定線索。

1 材料與方法

1.1材料 Osterix Lox P +/+ 小鼠、2.3 kb Collagen Ⅰ Cre小鼠和3.6- kb Cre Osterix 轉基因小鼠由美國德克薩斯州衛(wèi)生科學中心 Baylor醫(yī)學院Jerry Feng教授饋贈。Osterix Lox P +/+小鼠和2.3 kb Collagen Ⅰ Cre小鼠雜交以獲得Osterix Lox P +/+;2.3 kb Collagen Ⅰ Cre小鼠進而敲除Osterix。

1.2方法

1.2.1常規(guī)PCR進行基因型鑒定 取新生9 d小鼠適量尾巴，常規(guī)方法提取基因組DNA，然后取1 μg提取的DNA常規(guī)PCR進行基因型鑒定。Osterix敲除小鼠使用的引物為：5′-CTT GGG AAC ACT GAA GCT GT-3′和 5′-CTG TCT TCA CCT CAA TTC TAT T-3′；Osterix轉基因小鼠使用的引物為：5′-GAA GCG ACC ACT TGA GCA AAC AT-3′和5′- TGT CCA AAC TCA TCA ATG TAT CT-3′。

1.2.2X線片檢查 出生后12周，戊巴比妥那過量麻醉致死野生型小鼠、Osterix 轉基因小鼠和Osterix敲除小鼠(n=4)，取腰段脊柱，4%多聚甲醛4 ℃過夜固定，次日剔除脊柱周圍軟組織，拍攝脊柱X線片。

1.2.3顯微電子計算機X線斷層攝影術(micro-computerized tomography,Micro-CT)檢測 取上述小鼠第5腰椎，采用Micro-CT機(Scanco Medical,Bassersdorf,Switzerland)進行常規(guī)掃描，計算其骨量與脊椎總體積的比值(bone volume / total volume,BV/TV)。

1.2.4組織學處理 取上述標本中的第5腰椎10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣后，制備石蠟切片。冠狀面5 μm切片，常規(guī)脫蠟和梯度乙醇水化切片備用。

1.2.5蘇木素-伊紅(HE)染色 5 μm組織切片常規(guī)進行HE染色。方法簡述如下：取1.3中準備好的切片蘇木素染色5 min，自來水沖洗1～3 s后1%鹽酸乙醇分色1～3 s。蒸餾水過洗 1～2 s后0.5%伊紅染色 1 min，蒸餾水稍洗 1～2 s后梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封固切片。

1.2.6抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 預熱兩個裝有50 mL基礎孵育液的玻璃染色缸至37 ℃，然后在其中一個加入50 μL 2% 磷酸萘酚，加入1.2.3處理好的片子，37 ℃孵育45 min。然后將1 mL 5%副品紅和 1 mL 4%亞硝酸鈉混勻后加入另一個染色缸，將切片轉移到第二個染色缸，染色約2 min。蒸餾水漂洗后用甲基綠對抗染色，然后常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封固切片。其中基礎孵育液配制方法為將9.2 g無水醋酸鈉、11.4 g無水酒石酸鈉和2.8 mL冰醋酸加入蒸餾水，并定容為1 000 mL，并調(diào)節(jié)pH值為4.7～5.0。

1.2.7免疫組織化學染色 取1.2.3中準備好的切片，3%H2O2封閉切片用1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)充分漂洗后加非特異性封閉血清室溫封閉1 h后加羊抗兔RANKL一抗，4 ℃孵育過夜。次日PBS漂洗3次后加入相生物素化小鼠抗養(yǎng)二抗，室溫孵育1 h。PBS充分漂洗后DAB顯色，適度顯色后蒸餾水終止反應然后用甲基綠對抗染色。

2 結 果

2.1Osterix敲除小鼠骨量增加 Mico-CT結果顯示，Osterix轉基因小鼠中的骨小梁數(shù)量同野生型小鼠之間無明顯差異，而Osterix敲除小鼠第5腰椎中骨量大量增加，明顯高于野生型小鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖1。

A：野生型小鼠第5腰椎；B：Osterix轉基因小鼠腰椎；C：Osterix敲除小鼠腰椎；D：3種小鼠中骨量定量分析結果。

圖1 Micro-CT檢測3種小鼠脊椎中骨量的差別。

A：Osterix敲除小鼠(左)和野生型小鼠(右)的X線片；B:Osterix敲除小鼠的HE染色；C：野生型小鼠的HE染色；D：Osterix敲除小鼠的TRAP染色；E：野生型小鼠的TRAP染色；F：Osterix敲除小鼠的RANKL免疫組織化學染色；G：野生型小鼠的RANKL免疫組織化學染色。

圖2 Osterix敲除小鼠的特征

A：Osterix轉基因小鼠(左)和野生型小鼠(右)的X線片；B:Osterix轉基因小鼠的HE染色；C：野生型小鼠的HE染色；D：Osterix轉基因小鼠的TRAP染色；E：野生型小鼠的TRAP染色。

圖3 Osterix過表達轉基因小鼠的特征

2.2Osterix敲除小鼠破骨細胞數(shù)量減少 X線片檢測顯示在出生后12周，Osterix敲除小鼠脊椎骨密度增加，HE檢測顯示其椎體中骨量增加。采用TRAP染色檢測了Osterix敲除小鼠脊椎中破骨細胞的數(shù)量，結果發(fā)現(xiàn)Osterix敲除小鼠脊椎中破骨細胞的數(shù)量和染色強度明顯低于野生型小鼠。免疫組織化學染色結果顯示，Osterix敲除小鼠脊椎中RNAKL表達水平低于野生型小鼠，見圖2。

2.3Osterix過表達轉基因小鼠骨量無顯著變化 而在Osterix轉基因小鼠中，脊椎X線片顯示其密度和HE染色顯示其骨量同野生型小鼠無顯著差異。同時，TRAP染色和免疫組織化學檢測顯示Osterix轉基因小鼠脊椎中破骨細胞數(shù)量和RNAKL表達水平同野生型小鼠無顯著性差異，見圖3。

3 討 論

隨著世界人口日趨老齡化，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率越來越高，對中老年人的身體健康構成嚴重的威脅。骨質(zhì)疏松治療主要的目的是提高骨強度以減少骨折的發(fā)生率[7]。骨強度由多種因素決定，其中骨量是重要因素之一[8-10]。參與骨量調(diào)節(jié)的因素和信號轉導通路有多種，但尚不確定哪種因素或哪條信號通路起到重要作用[3,11-14]。

Osterix是成骨過程中重要的轉錄因子。胚胎期敲除Osterix導致小鼠完全沒有骨性成分形成，出生后敲除Osterix后小鼠的成骨細胞成熟和向骨細胞分化嚴重受阻[4-6]。這些結果提示，Osterix無論在胚胎期還是出生后的骨發(fā)育和骨成熟中起到重要作用。鑒于Osterix在成骨中的重要作用，筆者通過基因敲除和轉基因小鼠觀察了其在調(diào)控腰椎骨量中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Osterix過表達的轉基因小鼠骨量無明顯變化，而Osterix敲除小鼠腰椎骨量明顯增加，提示Osterix在調(diào)控小鼠腰椎骨量中起到不可或缺的重要作用。

由于成骨和破骨之間的平衡決定最終的骨量的多少，而有研究已經(jīng)證實Osterix敲除小鼠的成骨能力明顯低于野生型小鼠[4-6]。因此，筆者進一步觀察了Osterix敲除小鼠的破骨細胞的活性和數(shù)量變化情況，TRAP染色結果顯示，Osterix敲除小鼠脊椎中破骨細胞數(shù)量明顯下降。因而在Osterix敲除小鼠中，其成骨和破骨能力均下降，但后者下降的更明顯，導致總的效應為骨量增加。

在破骨細胞成熟的過程中，成骨細胞等分泌RANKL調(diào)節(jié)其成熟[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，Osterix敲除小鼠脊柱中RANKL的表達水平明顯下調(diào)，這是導致破骨細胞的數(shù)量明顯降低的原因。而破骨細胞數(shù)量的減少，導致成骨與破骨之間的平衡被打破，引起Osterix敲除小鼠脊椎中骨量增加。

綜上所述，Osterix在調(diào)控脊椎骨量中起到重要作用，其主要的作用機制是通過調(diào)節(jié)成骨和破骨細胞之間的平衡得以實現(xiàn)。而Osterix在調(diào)節(jié)脊椎骨量的過程中與其他信號通路之間的相互作用關系需要進一步觀察，以更好為治療骨質(zhì)疏松提供好的線索。

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