HPLC法測(cè)定丹梔逍遙散中梔子苷的含量

姜 勇（四川資中縣人民醫(yī)院，四川資中 641200）

HPLC法測(cè)定丹梔逍遙散中梔子苷的含量

姜 勇＊（四川資中縣人民醫(yī)院，四川資中 641200）

目的：建立測(cè)定丹梔逍遙散中梔子苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為AgilentTC-C18，流動(dòng)相為乙腈-水（15∶85，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm，流速為1.0m l/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μl。結(jié)果：梔子苷檢測(cè)質(zhì)量濃度在0.51～16.32 μg/m l范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r＝0.999 5）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤2.30%；平均加樣回收率為99.40%，RSD＝1.99%（n＝9）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于丹梔逍遙散中梔子苷的含量測(cè)定。

丹梔逍遙散；梔子苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

丹梔逍遙散又叫八味逍遙散，是調(diào)和肝脾劑，出自《內(nèi)科摘要》，是在《太平惠民和劑局方》中所載的“逍遙散”的基礎(chǔ)上加丹皮、梔子二藥制成，具有疏肝解郁、健脾和營(yíng)、兼清郁熱之功效[1-2]。主要用于肝郁血虛、內(nèi)有郁熱證，如潮熱晡熱、煩躁易怒，或自汗盜汗，或頭痛目澀，或頰赤口干，或月經(jīng)不調(diào)、少腹脹痛，或小便澀痛、舌紅苔薄黃、脈弦虛數(shù)等[3-5]。目前，關(guān)于丹桅逍遙散中桅子苷含量測(cè)定的報(bào)道較少，故筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-14]，采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)其中梔子苷的含量進(jìn)行測(cè)定，以為更好地控制其產(chǎn)品質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1200型HPLC儀，包括G1379A真空脫氣泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1311A四元泵、G1316A柱溫箱、G1315B二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司），78HW-1恒溫磁力攪拌器（江蘇金壇市中大儀器廠）；KQ-50B超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）；BS224S電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

梔子苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110749-201102）；丹梔逍遙散（四川省中醫(yī)藥研究院，批號(hào)：20121209、20121211、20121213）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（15∶85，V/V）；流速：1.0m l/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液 精密稱取梔子苷對(duì)照品0.001 02 g，置于50m l量瓶中，加入70%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1m l含0.020 4mg的梔子苷對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 稱取丹梔逍遙散粉末約0.4 g，置于50m l量瓶中，加入70%甲醇溶液50m l，超聲處理30min（功率：150 W，頻率：40 kHz），搖勻，用0.45μm孔徑微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按丹梔逍遙散的處方制備不含梔子藥材的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，即得陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μl進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，供試品溶液中梔子苷峰保留時(shí)間與對(duì)照品溶液中梔子苷峰保留時(shí)間一致，且與相鄰雜質(zhì)峰分離度較好；陰性對(duì)照溶液在梔子苷峰相應(yīng)位置處無吸收峰，說明其對(duì)含量測(cè)定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.梔子苷Fig 1 HPLC chromatogram sA.substance control；B.test sample；C.negative control；1.geniposide

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00m l，分別置于20m l量瓶中，加入70%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，每個(gè)濃度進(jìn)樣10μl，記錄色譜。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，檢測(cè)質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝258.63x+89.02（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，梔子苷檢測(cè)質(zhì)量濃度在0.51～16.32μg/m l范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄梔子苷的峰面積。結(jié)果，RSD＝0.91%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20121209）適量，分別于放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)進(jìn)樣，記錄梔子苷的峰面積。結(jié)果，RSD＝1.62%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號(hào)：20121209）5份，各約0.4 g，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算梔子苷的含量。結(jié)果，RSD＝2.30%，表明本方法的重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20121209）9份，各約0.28 g，分別加入“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液12、16、18 m l，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.9 樣品含量測(cè)定

稱取3批丹梔逍遙散樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取對(duì)照品溶液和3批供試品溶液各10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計(jì)算其中梔子苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab 2 Results of content determ ination of sam p les（mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取梔子苷對(duì)照品溶液作紫外光譜掃描，結(jié)果可見在237.8 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且在（237.8±2）nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收穩(wěn)定，基線較好，對(duì)測(cè)定無干擾。因此，筆者參考2010年版《中國(guó)藥典》（一部）中關(guān)于梔子藥材中梔子苷的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的最大吸收波長(zhǎng)，并結(jié)合本研究，最終選用238 nm作為本試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]，筆者曾采用了不同比例的乙腈-水作為流動(dòng)相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著流動(dòng)相中乙腈的減少，梔子苷的保留時(shí)間不斷延長(zhǎng)，峰形不佳；而隨著乙腈的增加，梔子苷與相鄰雜質(zhì)峰的分離度不斷減小，當(dāng)乙腈與水比例為15∶85時(shí)，梔子苷的峰形較好，且與相鄰雜質(zhì)峰能達(dá)到較好的分離，保留時(shí)間適中。故選擇乙腈-水（15∶85，V/V）作為流動(dòng)相。

3.3 超聲提取方法的選擇

筆者曾分別采用50%甲醇、70%甲醇、80%甲醇和水進(jìn)行了超聲提取。結(jié)果表明，采用70%甲醇提取時(shí)，測(cè)得梔子苷的含量較高。同時(shí)，又分別以70%甲醇超聲15、30、45min進(jìn)行比較。結(jié)果表明，超聲30m in時(shí)，色譜中的雜質(zhì)峰較少，提取效果最好，且對(duì)測(cè)定梔子苷的含量影響較小。故選擇70%甲醇超聲提取30m in。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于丹梔逍遙散中梔子苷的含量測(cè)定。

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Content Determ ination of Geniposide in Danzhi Xiaoyao Powder by HPLC

JIANG Yong（Zizhong County People’s Hospital of Sichuan Province，Sichuan Zizhong 641200，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determ ination of geniposide in Danzhi xiaoyao powder. METHODS：HPLC method was adopted.The determ ination was performed on Agilent TC-C18column w ith mobile phase consisted of acetonitrile-water（15∶85，V/C）at a flow rate of 1.0m l/min.The detection wavelength was 238 nm and the column temperature was set at 30℃.The sample size was 10μl.RESULTS：The linear range of geniposide was 0.51-16.32μg/m l（r＝0.999 5）.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.30%；average recovery was 99.40%（RSD＝1.99%，n＝9）. CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for content determination of jasminoidin in Danzhi xiaoyao powder.

Danzhi xiaoyao powder；Geniposide；HPLC；Content determination

R917

A

1001-0408（2014）12-1125-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.12.24

＊主管藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0832-5526282。E-mail：jjyy9941370@163.com

2013-12-13

2014-01-07）