Tween-60協(xié)同微波提取桑椹總黃酮的研究

韓 偉 徐劍宇 方若舟 黃伯駿

（華東理工大學(xué)中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237）

0 引言

桑葚，又名桑葚子、桑實(shí)、黑葚、桑果，為桑科植物桑的果穗。我國(guó)的桑樹(shù)種類以及桑葚產(chǎn)量均居世界首位，曬干或蒸后曬干即可作為中藥材原料。桑椹中含有豐富的黃酮類化合物，如蘆丁、花青素等，佟繼銘等研究發(fā)現(xiàn)總黃酮有較好的抗心律失常[1]和降低血壓[2]的作用，同時(shí)具有良好的抗衰老、抗?jié)?、抗病毒等作用[3]，醫(yī)用價(jià)值顯著。但到目前為止，對(duì)桑椹總黃酮提取工藝的報(bào)道還較為少見(jiàn)。

桑椹總黃酮傳統(tǒng)的提取方法為水提法，其提取率較低，高靜等[4]研究得到桑葚的提取率僅為0.24%。隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的推進(jìn)，超臨界提取、超聲波提取、微波輔助萃取等新技術(shù)迅速涌現(xiàn)[5～7]。

微波輔助提取（MAE）和表面活性劑輔助提取是近年來(lái)興起的新型提取技術(shù)，與傳統(tǒng)的提取方法相比，其具有快速、高效、節(jié)能[8]的優(yōu)點(diǎn)。目前，微波萃取已廣泛應(yīng)用于中草藥有效成分的提取中[9]。本文以桑葚為體系，采用表面活性劑輔助微波法提取桑椹總黃酮，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定各因素的影響順序，并得出最佳的提取工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與設(shè)備

藥材：桑葚1 kg/袋，上海華宇藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（＞95%），中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)；實(shí)驗(yàn)所用的其他試劑均為分析純。

儀器與設(shè)備：UV1900PC紫外分光光度計(jì)，上海亞研電子儀器科技有限公司生產(chǎn)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠生產(chǎn)；JY5002電子天平，上海良平儀器儀表有限公司生產(chǎn)；SK3310HP超聲清洗儀，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司生產(chǎn)；ER-692微波提取裝置，中國(guó)電子器件工業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)的具體方法：（1）將干燥的桑葚粉碎備用；（2）準(zhǔn)確稱取桑葚粉3.00 g；（3）以一定比例加入去離子水；（4）加入一定量的表面活性劑；（5）微波處理供試液；（6）抽濾所得供試液；（7）顯色后測(cè)定供試液吸光度；（8）計(jì)算黃酮得率。

1.3 總黃酮分析方法的建立

本實(shí)驗(yàn)利用黃酮類化合物在堿性條件下與A l3+形成穩(wěn)定有色絡(luò)合物，且在紫外—可見(jiàn)光分光光度計(jì)500～515 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有最大吸收的特性，采用中國(guó)藥典所收載的亞硝酸鈉—硝酸鋁—?dú)溲趸c比色法[10]來(lái)測(cè)定黃酮的含量。

1.3.1 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

1.3.1.1 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.0212g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，溶于100m L的容量瓶中，得到0.212mg/m L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

供試品溶液：即經(jīng)微波輔助提取后抽濾所得的濾液。

1.3.1.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.212 mg/m L）及供試品溶液各2m L，分別置于25m L容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉試液1 m L，靜置6 m in；加入10%硝酸鋁試液1 m L，靜置6 min；加入4%氫氧化鈉試液10m L，并補(bǔ)加水至刻度，靜置15m in。之后以相應(yīng)試劑作為空白對(duì)照，于紫外—可見(jiàn)光分光光度計(jì)400～650 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示。將供試品溶液稀釋到合適的倍數(shù)，作相同處理，于400～650 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果如圖2所示，確定最大吸收波長(zhǎng)為500 nm。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的波長(zhǎng)掃描結(jié)果

圖2 桑葚樣品溶液的波長(zhǎng)掃描結(jié)果

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[11]

分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（0.212 mg/m L）1 m L、2m L、3m L、4m L、5m L、6m L、7m L、8m L，各置于25m L量瓶中，按1.3.1.2所述的顯色方法顯色，以相應(yīng)試劑作為空白對(duì)照組，使用紫外—可見(jiàn)光分光光度計(jì)在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以測(cè)得的吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度C（mg/m L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=11.877C－0.009，線性濃度范圍為0.008 6～0.068 5mg/m L，R2=0.999 7?？梢?jiàn)A與濃度C之間呈良好的線性關(guān)系，可按標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出供試品溶液中黃酮的濃度C（mg/m L），可根據(jù)下式計(jì)算總黃酮的得率：

式中C——樣品中黃酮的濃度，mg/m L；

V——溶劑量，m L；

M——桑葚的質(zhì)量，g；

n——溶液稀釋倍數(shù)。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察表面活性劑的種類和濃度、液固比、微波輻射時(shí)間等因素對(duì)桑葚總黃酮得率的影響。

1.5 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)黃酮得率影響較大的因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素水平表如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9（34）

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 表面活性劑的種類

圖4 為不同表面活性劑輔助提取桑葚總黃酮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖可知，Tween-60對(duì)微波提取的輔助作用為最優(yōu)。Tween-60屬于水溶性表面活性劑，在水提過(guò)程中有良好的增溶作用，且其毒性較其他表面活性劑小，適于黃酮的提取，故選擇Tween-60作為表面活性劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同表面活性劑輔助提取桑葚總黃酮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 表面活性劑濃度

圖5 為表面活性劑濃度對(duì)桑葚總黃酮的提取結(jié)果的影響，由圖可知，表面活性劑濃度在1.5 g/L時(shí)黃酮得率最高。當(dāng)表面活性劑濃度較低時(shí)，增大表面活性劑用量可以顯著增加藥液體系中膠束的含量，從而大幅提升總黃酮的溶出率。但當(dāng)膠束含量達(dá)到臨界值時(shí)，繼續(xù)增加表面活性劑用量不能形成有效的膠束，故其對(duì)于黃酮溶出率的影響變小甚至消失。而過(guò)多的表面活性劑會(huì)影響溶液整體的傳質(zhì)與傳熱，阻礙桑葚總黃酮的溶出。所以，此種情況下的表面活性劑濃度以1.5 g/L為宜。

2.1.3 液固比

液固比對(duì)桑葚總黃酮的提取結(jié)果影響如圖6所示，可以看出，當(dāng)液固比為40m L/g時(shí)，黃酮得率最高。這是因?yàn)樵谝欢ǖ姆秶鷥?nèi)增加液固比，將使藥材與溶劑之間的濃度差增大，傳質(zhì)推動(dòng)力增加，有利于黃酮的溶出；但液固比過(guò)大，溶劑吸收的微波能量也會(huì)增加，從而減少了藥材對(duì)能量的吸收，即溶液?jiǎn)挝惑w積中藥材所獲得的微波能會(huì)相應(yīng)減少，造成得率降低。故液固比取40m L/g為宜。

圖5 表面活性劑濃度對(duì)桑葚總黃酮的提取結(jié)果影響

2.1.4 微波輻射時(shí)間

圖7 為微波輻射時(shí)間對(duì)總黃酮提取結(jié)果的影響。由圖可知，微波輻射時(shí)間在180 s時(shí)黃酮得率最高。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)增加微波時(shí)間，能使體系獲得更多的能量，加速桑葚細(xì)胞壁的破裂，使總黃酮易于溶出。當(dāng)微波時(shí)間超過(guò)180 s后，由于微波劑量過(guò)大，部分黃酮可能因?yàn)槲⒉訜釙r(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致體系過(guò)熱而產(chǎn)生分解，使得率降低。故提取時(shí)間以180 s為宜。

圖6 液固比對(duì)桑葚總黃酮的提取結(jié)果影響

圖7 微波輻射時(shí)間對(duì)總黃酮提取結(jié)果的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)黃酮得率影響較大的因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果如表2所示。由表2直觀分析可知，當(dāng)以黃酮得率為考察指標(biāo)時(shí)，有A2＞A3＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，即各因素對(duì)桑葚總黃酮得率的影響程度依次為B＞A＞C，即液固比＞Tween-60濃度＞微波輻射時(shí)間；最優(yōu)工藝條件為A2B2C2，即以水為溶劑，Tween-60作為表面活性劑，濃度為1.5 g/L，液固比取40m L/g，微波輻射時(shí)間180 s。經(jīng)過(guò)重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)可知，該工藝條件下總黃酮的得率穩(wěn)定在2.051%左右。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

本文以桑葚總黃酮的得率為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選表面活性劑輔助微波提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明，對(duì)總黃酮得率影響最大的因素為液固比，其次為T(mén)ween-60濃度、微波輻射時(shí)間。最優(yōu)工藝條件為：以水為溶劑，Tween-60作為表面活性劑，濃度為1.5 g/L，液固比為40m L/g，微波時(shí)間為180 s，在該操作條件下，桑葚總黃酮的得率為2.051%，且穩(wěn)定性良好。

［1］佟繼銘，符景春.黃芩莖葉總黃酮抗實(shí)驗(yàn)性心律失常作用觀察［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991（3）

［2］胡亞軍，林大正.黃芩莖葉總黃酮抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008（3）

［3］吳祖芳，翁佩芳.桑椹的營(yíng)養(yǎng)組分與功能特性分析［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2005（3）

［4］高靜，呂志強(qiáng)，周長(zhǎng)凱，等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)選桑籽總黃酮提取工藝的研究［J］.齊魯藥事，2012（12）

［5］趙明明，熊海蓉，李霞，等.石蒜中石蒜堿的超聲波提取研究［J］.化學(xué)與生物工程，2011（8）

［6］張瑞菊，張國(guó)英，孫海波，等.苦參中黃酮類化合物的超臨界提取及定性研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（7）

［7］聶金媛，張夢(mèng)軍，吳世容，等.微波輔助提取方法和技術(shù)在中藥與天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用［J］.長(zhǎng)沙大學(xué)學(xué)報(bào)，2003（4）

［8］駱健美，盧學(xué)英，張敏卿，等.微波萃取技術(shù)及其應(yīng)用［J］.化工進(jìn)展，2001（12）

［9］張玲玲，黃兮，邱紹兵，等.微波輔助提取桑葚多糖的工藝研究［J］.山東化工，2012（12）

［10］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2012

［11］唐紅軍.中國(guó)藥典2000年版一部檢測(cè)蘆丁含量方法的改進(jìn)［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2002（1）