響應曲面法優(yōu)化酶解提取玉米黃色素工藝參數(shù)

鐘振聲，高怡然

（華南理工大學化學與化工學院，廣東廣州510640）

玉米蛋白粉俗稱黃粉子，是玉米淀粉加工過程中的副產(chǎn)品，呈淡黃色，其蛋白質(zhì)含量較高，含少量碳水化合物、脂肪和灰分，還含有一定量的玉米黃色素[1-2]，隨著我國玉米深加工業(yè)的發(fā)展，玉米蛋白粉的產(chǎn)出量也在逐年增加，預計2009年可達400 萬t 以上，資源量相當可觀。但目前我國絕大多數(shù)企業(yè)僅將玉米蛋白粉作為飼料利用，附加值很低，若能利用玉米蛋白粉進一步開發(fā)高附加值產(chǎn)品，則可大幅度提高玉米深加工企業(yè)的經(jīng)濟效益，延長玉米產(chǎn)業(yè)鏈，促進玉米經(jīng)濟的發(fā)展[2-3]。

玉米黃色素是一種天然食用色素，屬異戊二烯類，主要由玉米黃素（3，3′-二羥基-β-胡蘿卜素）、隱黃素（3-羥基-β-胡蘿卜素）及葉黃素（3，3′-二羥基-α-胡蘿卜素）等組成，其中玉米黃素是黃玉米所含的主要色素，這些組分均為類胡蘿卜素的混合物[4]。玉米黃色素可用于人造黃油，人造奶油等食品中，其著色效果良好，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。近年來還發(fā)現(xiàn)玉米黃色素具有不可多得的營養(yǎng)保健功效，因此在食品、飲料、醫(yī)藥行業(yè)有著廣泛的應用前景[5-6]。

玉米黃色素的提取，一般是利用有機溶劑如石油醚，丙酮，已烷，乙醇等對玉米蛋白粉進行萃取，并經(jīng)過濃縮而獲得色素制品[7]。據(jù)文獻可知，玉米黃色素在玉米蛋白粉中通常與蛋白結(jié)合呈絡(luò)合物的狀態(tài)存在，如果單純用溶劑浸提，得到的玉米黃色素量較少[8-10]。

本研究采用蛋白酶作為輔助，以無水乙醇浸提玉米蛋白粉提取玉米黃色素。在提取過程中，影響提取效率的因素很多，本文運用響應面法[11-13]優(yōu)化酶解輔助提取玉米黃色素的工藝參數(shù)，力圖提高黃色素的提取率。響應面法是利用合理的試驗設(shè)計，采用多元二次回歸方程擬合因素和響應值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法，可以快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米蛋白粉：工業(yè)品；中性蛋白酶：購于北京鼎國生物科技有限公司；無水乙醇為分析純試劑。

752-P 紫外-可見分光光度計：上?，F(xiàn)科儀器有限公司；SHZ-82A 空氣搖床：常州奧華儀器有限公司；TGL-16gR 冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；pHS-25型精密pH 計：上海精科儀器廠；U3010 紫外-可見分光光度計：日本HITACHI 公司。

1.2 方法

1.2.1 溶劑選擇及最大吸收波長的確定

稱取2.0 g 玉米蛋白粉，加入20 mL 溶劑，室溫浸提1.5 h，抽濾。取濾液于400 nm～500 nm 波長進行波譜掃描，繪制波長-吸光度曲線。測出色素吸收峰所對應的最大吸收波長后，在此波長下測定不同條件提取出來的色素的吸光度。

1.2.2 玉米黃色素的提取

取25 g 玉米蛋白粉，加約400 mL 蒸餾水，調(diào)pH 7.0，加入1 mL 中性蛋白酶，40 ℃下水解2 h，離心殘渣于40 ℃烘箱熱風干燥。分別取玉米蛋白粉2.0 g 于5 個三角燒瓶中，分別加入20 mL 無水乙醇，然后置于45 ℃恒溫水浴中，分別浸提1、2、3、4、5 h。浸提液定容至100 mL，測定其吸光度。

1.2.3 玉米黃色素提取率的測定

采用 AACC（American Association of Cereal Chemists）法[14]，用總胡蘿卜素的含量表達樣品中黃色素的有效含量。準確稱取樣品0.6 g，加入40 mL 水飽和丁醇溶液，浸提3 h，并不時輕輕振蕩。用濾紙過濾得上清液，用紫外-可見分光光度計在445 nm 處測吸光度。以提取物吸光度/玉米黃粉吸光度來表達提取率。測得玉米黃粉吸光度為0.710。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

按照1.2.1 的方法，用無水乙醇作為提取溶劑，測定玉米黃色素的波長-吸光度曲線如圖1 所示。

可見其最大吸收波長為445 nm。以下實驗均為在此波長下的吸光度值。

2.2 蛋白酶水解的單因素試驗

圖1 玉米黃色素的波長-吸光度曲線Fig.1 Wavelength-absorbance curve of yellow pigment

據(jù)文獻報道，類胡蘿卜素在40 ℃以下較穩(wěn)定[15]，45 ℃時玉米蛋白粉中的游離玉米黃色素受到溫度的影響可能損失從而降低得率。本實驗使用的中性蛋白酶的最適宜溫度為40 ℃左右。鑒于這兩點考慮，確定本實驗的水解溫度為38 ℃。中性蛋白酶的最適pH 為6～7，在這個范圍里的pH 對玉米黃色素提取效率影響不大，故確定水解試驗pH7.0。

2.2.1 水解時間的影響

分別取5 g 玉米蛋白粉，使其底物濃度為3%，酶濃度為1%，pH7.0，38 ℃下水解，結(jié)果見圖2。

圖2 水解時間對玉米黃色素提取效率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction of yellow pigment

吸光度變化比較大的水解時間段為4 h～8 h，因此，選擇4、6、8 h 3 個水平做以下Box-Behnken 實驗。

2.2.2 底物濃度的影響

分別取5 g 玉米蛋白粉，使其酶濃度為1%，pH 7.0，38 ℃下水解6 h，結(jié)果見圖3。

圖3 底物濃度對玉米黃色素提取效率的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the extraction of yellow pigment

吸光度變化比較大的底物濃度范圍為3%～7%，因此，選擇底物濃度3%，5%，7 % 3 個水平做以下Box-Behnken 實驗。

2.2.3 酶濃度的影響

分別取5 g 玉米蛋白粉，使其底物濃度為5%，pH 7.0，38 ℃下水解6 h，結(jié)果見圖4。

圖4 酶濃度對玉米黃色素提取效率的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on the extraction of yellow pigment

吸光度變化比較大的酶濃度范圍為2.2 %～3 %，故選擇酶濃度2.2%，2.6%，3%3 個水平做以下Box-Behnken 實驗。

2.3 響應面法優(yōu)化蛋白酶水解過程

2.3.1 試驗設(shè)計及結(jié)果

三水平三因素的響應面分析實驗。共有15 個試驗點，其中12 個位析因點，3 個位零點以估計誤差。因素水平見表1，試驗結(jié)果如表2。

表1 Box-Behnken 實驗因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

表2 Box-Behnken 實驗設(shè)計表及其試驗結(jié)果Table 2 Results analysis of Box-Behnken experiment

將以上試驗結(jié)果用Design-Expert 軟件進行數(shù)據(jù)分析，分析結(jié)果擬合得到響應值A(chǔ)445 和各因子（X1：水解時間；X2：底物濃度；X3：酶濃度）的回歸方程為：

提取率= -52.983 01-7.509 54X1-17.159 57X2+146.62338X3-0.46377X1X2+1.42699X1X3+13.4375X2X3+0.668 90X12-1.447 80X22-43.33X32

2.3.2 響應面結(jié)果分析

響應面的回歸系數(shù)分析見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 二次多項式回歸系數(shù)Table 3 Regression coefficients of quadratic polynomial

表4 響應曲面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA results of quadratic response surface regression model

從表4 可知，該二次回歸模型顯著（p=0.004 5＜0.05），失擬項不顯著（p=0.384 5），說明該模型和試驗擬合良好，可用于酶解提取玉米黃色素試驗的分析和預測。模型的可信度分析見表5。

表5 模型的可信度分析Table 5 Reliability analysis of model

其中信噪比為12.220＞4，可知回歸方程擬合度和可信度均較高，試驗誤差較小。

根據(jù)回歸方程做響應面，考察擬合的響應面的形狀，分析水解時間、底物濃度和酶濃度對玉米黃色素的提取率，其響應面如圖5、圖6 和圖7 所示。

圖5 水解時間，底物濃度及其交互作用對玉米黃色素提取率的影響和等高線Fig.5 Effects of hydrolysis time，substrate concentration and interaction on the extraction of yellow pigment and contour line

圖6 水解時間，酶濃度及其交互作用對玉米黃色素提取率的影響和等高線Fig.6 Effects of hydrolysis time，enzyme concentration and interaction on the extraction of yellow pigment and contour line

圖7 酶濃度，底物濃度及其交互作用對玉米黃色素提取率的影響和等高線Fig.7 Effects of enzyme concentration，substrate concentration and interaction on the extraction of yellow pigment and contour line

圖5 表示水解時間和底物濃度對提取率的交互作用情況，由圖5 中等高線圖可知，等高線沿水解時間方向變化相對密集，說明水解時間對響應值的影響比底物濃度大；圖6 表示水解時間和酶濃度對提取率的交互作用情況，圖6 中，等高線沿酶濃度方向變化相對密集，說明酶濃度對響應值的影響比水解時間大；由圖7 可知，等高線密度沿酶濃度和底物濃度方向相當，可知對響應值的影響相當。

3 結(jié)論

本研究采用響應面分析法優(yōu)化酶解輔助乙醇提取玉米黃色素的工藝，以水解時間、底物濃度、酶濃度為主要因素進行Box Behnken 試驗，建立了玉米黃色素提取率的回歸方程為

提取率= －52.983 01－7.509 54X1－17.159 57X2+146.623 38X3－0.463 77X1X2+1.426 99X1X3+13.437 5X2X3+0.668 90X12－1.447 80X22－43.33X32

試驗結(jié)果表明，當提取工藝中水解時間為8 h，底物濃度為4.48 %，酶濃度為2.52 %時提取率達到81.053%，與Design expert 軟件預測的81.996%僅相差1.15%，說明該模型可靠。在各影響因子中，水解時間對響應值的影響比底物濃度大，酶濃度對響應值的影響比水解時間大，酶濃度和底物濃度對響應值的影響相當。

經(jīng)過用響應面法優(yōu)化酶法輔助提取玉米黃色素，提取率比傳統(tǒng)的乙醇提取法（提取率16.125%）提高了5 倍。

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