棕筍中酚酸類化合物的提取及抗氧化活性研究

梁華倫，江秀娟，陳地靈

（1.廣東省中醫(yī)院二沙分院藥劑科，廣州廣東510515；2.廣州市海珠區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州510250；3.廣東省微生物研究所，廣東廣州510070）

棕櫚[Trachycarpus fortunei（Hook.）H.Wendl.]是中國最普遍的土生土長的棕櫚科植物，它原產(chǎn)中國中南部山地，是最耐寒的棕櫚，在我國長江以南地區(qū)廣泛栽培，現(xiàn)在世界上許多國家已有引種。棕櫚既是觀賞植物，又是經(jīng)濟(jì)植物；全身（根、莖、葉、花和種子）都有用，其中含有多種化學(xué)成分，有很高的利用價(jià)值。棕筍為棕樹（Fortunes Windmill Plam）的花穗，花單性，肉質(zhì)圓錐花序生于葉叢中，有明顯的大形花苞，花淡黃色而細(xì)小，初出苞的花穗花小多數(shù)密集如魚子，古稱棕筍（又名木魚）?；ㄝ嗪突ü诰?，雄蕊6 枚，子房三室，心皮基部合生，花期4～5月[1]。分布全國各地，資源豐富?！侗静菥V目》認(rèn)為，其筍及子花，氣味：苦、澀、平，無毒。主治澀腸，止瀉痢腸風(fēng)，崩中帶下。常作為菜果食用，也可制糖[2]。其含有大量酚酸類、黃酮類化合物，還含有色素類、微量元素、揮發(fā)油等成分[3]，具有多種生物活性[4-7]。本實(shí)驗(yàn)就其酚酸類成分開展提取工藝篩選研究，以期為其資源的綜合開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

紫外可見光分光光度計(jì)：美國Agilent8453E 型；德國Sartorius BP211D 電子分析天平（d=0.000 01 g）；XS 225A 型分析天平（d=0.000 1 g）。戴安Ultimate 3000型高效液相色譜儀（包括四元泵，自動進(jìn)樣器，柱溫箱，DAD 檢測器，Chromeleon 工作站）；AR224CN 電子天平（d=0.0001 g）：奧豪斯儀器（上海）公司；SK3300LH超聲儀：托利多儀器上海有限公司；IKA RV10 HB10 basic 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA；HHS-4S 水浴鍋：上海宜昌儀器紗篩廠；Memmert model 100-800 烘箱：德國Memmert 公司。Acclaim C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Dionex），Syncronis aQ C18（250 mm×4. 6 mm，5 μm，Thermo）；TDL-2B 離心機(jī)（Anke 公司）；ELX808 多功能酶標(biāo)儀：Bio-tek，美國；Agilent8453E 型紫外可見光分光光度計(jì)：Agilent 公司，美國。

1.2 材料

棕筍于2013年2月采集江西贛州贛縣，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院林勵研究員鑒定為棕櫚科[Trachycarpus fortunei（Hook.）H.Wendl.]線棕的未開放花蕾。經(jīng)70 ℃烘干，標(biāo)本存于華南師范大學(xué)藥物研究院植物標(biāo)本室（編號：ZS20130221）。沒食子酸（MUST-13040103）、原兒茶酸（MUST-12103006）、原兒茶醛（MUST-13021902）和咖啡酸（MUST-12042403）對照品均購自于成都曼斯特生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2- picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1- （2，4，6-trinitro phenyl）hydrazyl，DPPH·），Sigma Aldrich Chemical Co.（USA），批號20110304；抗壞血酸，Sigma Aldrich Chemical Co.（USA），批號20100226；三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA），天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號20100201；硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituric acid，TBA），aladdin chemistry co.Ltd，批號49837；液相用乙腈為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液制備

2.1.1 對照品溶液制備

分別取干燥至恒重的沒食子酸、原兒茶酸、原兒茶醛和咖啡酸對照品適量，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加20%甲醇溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得含濃度分別為0.064、0.208、0.048、0.156 mg/mL 的沒食子酸、原兒茶酸、原兒茶醛和咖啡酸混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備

取棕筍粉末2 g，精密稱定，加入20%乙醇25 mL，在80 ℃水浴中浸提30 min，提取2 次，濾過，少量20 %乙醇洗滌藥渣，合并，定容到100 mL，即得供試品溶液。

2.2 總酚酸的測定

取沒食子酸對照品適量，精密稱定，于50 mL 容量瓶中，加20%甲醇溶解并稀釋至刻度，配成0.61 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4 mL 于10 mL離心管中，加入0.2 mol/L FC 試劑1 mL、15%Na2CO3溶液2 mL，蒸餾水定容至8 mL，25 ℃反應(yīng)2 h。另精確吸取20%乙醇0.4 mL，同法操作作為空白對照。在765 nm波長處測量其吸光度。繪制吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合線性回歸方程，A=1.425 8C+0.034 9，r=0.999。線性范圍0.122 0 mg/mL～0.610 0 mg/mL。

2.3 4 種酚酸類成分的含量測定

色譜條件，Acclaim C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Dionex）色譜柱，流動相乙腈-0.4%磷酸水，梯度洗脫，柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min，檢測波長275 nm。并參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率等方法學(xué)考察試驗(yàn)。結(jié)果沒食子酸、原兒茶酸、原兒茶醛和咖啡酸在棕筍中均能達(dá)到很好的分離，見圖1，同時(shí)方法學(xué)考察試驗(yàn)結(jié)果顯示均符合要求。

圖1 棕筍對照品和樣品HPLC 圖譜Fig.1 Chromatograms of the four mixed reference standards and the sample of the buds of T.fortunei

2.4 單因素考察試驗(yàn)

2.4.1 料液比對棕筍酚酸類成分提取率的影響

取棕筍粉末2 g，精密稱定，按料液比分別為10、20、30、50 倍（g/mL）加入50%乙醇，在80 ℃水浴中浸提30 min，提取2 次。濾過，少量50%乙醇洗滌藥渣，合并，定容到200 mL，0.4 mL 于10 mL 離心管中，照“2.2”項(xiàng)下方法，在765 nm 波長處測量其吸光度，計(jì)算總酚酸類成分提取率；照“2.3”項(xiàng)下方法，測定4 種酚酸類成分含量，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對棕筍酚酸類成分提取率的影響Fig.2 Effects of ratio of liquid to solid on extraction of the buds of T.fortunei

實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如圖2 顯示，不同料液比的棕筍酚酸類成分提取率無顯著性差異（p＞0.05），從環(huán)保和節(jié)能角度出發(fā)，選擇料液比10 倍量。

2.4.2 乙醇濃度對棕筍酚酸類成分提取率的影響

取棕筍粉末2 g，精密稱定，按料液比10 倍，分別加入10 %、30 %、50 %、70 %、100 %乙醇（ν ∶ν），在80 ℃水浴中浸提30 min，提取2 次。濾過，少量相應(yīng)濃度乙醇洗滌藥渣，合并，定容到200 mL，照“2.2”項(xiàng)下方法，在765 nm 波長處測量其吸光度，計(jì)算總酚酸類成分提取率；照“2.3”項(xiàng)下方法，測定4 種酚酸類成分含量，結(jié)果見圖3。

圖3 乙醇濃度對棕筍酚酸類成分提取率的影響Fig.3 Effects of concentration of alcohol on extraction of the buds of T.fortunei

從圖3 中可以看出，隨乙醇濃度的升高，酚酸類成分提取率逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)，提取率達(dá)到最大，往后隨著醇濃度的加大，酚酸類成分提取率變化不大。

2.4.3 提取時(shí)間對棕筍酚酸類成分提取率的影響

取棕筍粉末2 g，精密稱定，按料液比10 倍加入50%乙醇，在80 ℃水浴中分別浸提15、30、45、60、75、90 min，提取2 次。濾過，少量50%乙醇洗滌藥渣，合并，定容到200 mL，照“2.2”項(xiàng)下方法，在765 nm 波長處測量其吸光度，計(jì)算總酚酸類成分提取率；照“2.3”項(xiàng)下方法，測定4 種酚酸類成分含量結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對棕筍酚酸類成分提取率的影響Fig.4 Effects of extracting times on extraction of the buds of T.fortunei

提取時(shí)間考察試驗(yàn)結(jié)果表明，棕筍酚酸類成分提取率隨提取時(shí)間的延長而增大，并在30 min 時(shí)提取率達(dá)到最大，繼續(xù)延長時(shí)間，提取率基本保持不變。

2.4.4 提取溫度對棕筍酚酸類成分提取率的影響

取棕筍粉末2 g，精密稱定，按料液比10 倍加入50%乙醇，分別在30、50、70、90 ℃水浴中浸提30 min，提取2 次。濾過，少量50%乙醇洗滌藥渣，合并，定容到200 mL，照“2.2”項(xiàng)下方法，在765 nm 波長處測量其吸光度，計(jì)算總酚酸類成分提取率；照“2.3”項(xiàng)下方法，測定4 種酚酸類成分含量，結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對棕筍酚酸類成分提取率的影響Fig.5 Effects of extracting temperature on extraction of the buds of T.fortunei

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，棕筍酚酸類成分提取率隨提取溫度的升高而增大，并在50 ℃達(dá)到最大，隨后提取率隨溫度升高基本不變。

2.5 正交試驗(yàn)

采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步考察乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）對棕筍酚酸類成分提取率的影響，以總酚酸提取率（T1）和4 種酚酸類成分總含量（T2）各占50%為考核指標(biāo)，確定最佳提取工藝。因素與水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析Table 2 Result of L9（34）orthogonal experiment and analysis

結(jié)果如表2 所示，方差分析結(jié)果見表3。

表3 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3 ANOVA analysis of L9（34）orthogonal experiment

由表2 可知，影響棕筍酚酸類成分提取的主次因素為B＞C＞A，即提取時(shí)間＞提取溫度＞乙醇濃度。從表3 可知各因素對棕筍酚酸類成分提取率的影響均未達(dá)到顯著水平，其最佳提取工藝條件應(yīng)為A1B2C2，即乙醇濃度50%、溫度50 ℃、每次提取30 min、提取2 次。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述最佳提取工藝對棕筍酚酸類成分進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果5 次實(shí)驗(yàn)得到提取液中總酚酸類成分平均含量為50.79 mg/g，RSD%=1.26，4 種成分總量為6.35 mg/g，RSD%=1.25，說明最佳工藝條件穩(wěn)定可靠，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of verifying test

2.7 抗氧化活性測定

2.7.1 DPPH 法測定抗氧化能力[8]

準(zhǔn)確移取樣品待測液2.0 mL，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液（取適量DPPH 固體溶解于80 %乙醇的50 mmol/L Tris-HCl 溶液中），混勻，放置一段時(shí)間，以無水乙醇調(diào)零，測定517 nm 波長處的吸光度，記為A樣品。準(zhǔn)確移取樣品待測液2.0 mL 與無水乙醇2.0 mL，混勻，放置一段時(shí)間，在517 nm 處的吸光度，記為A對照。準(zhǔn)確移取DPPH 溶液2.0 mL 與無水乙醇2.0 mL，混勻，在517 nm 波長處的吸光度，記為A空白，按下公式計(jì)算DPPH 清除率：

2.7.2 清除·OH 能力測定-脫氧核糖法[9]

取1.5 mL 反應(yīng)液（0.1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L FeCl3，2.8 mmol/L 脫氧核糖），先后加入0.1 mL 抗壞血酸（1 mmol/L），0.35 mLH2O2（20 mmol/L），37 ℃水浴30 min。上述混合液加入1 mL 樣本溶液再次37 ℃水浴30 min，隨后依次加入0.3 mL TBA（0.2 mmol/L）和1 mL TCA（0.06 mmol/L）100 ℃水浴15 min，532 nm 處測定吸光值A(chǔ)1（以蒸餾水代替TBA 作為空白調(diào)零），同時(shí)用1 mL 蒸餾水代替樣本溶液時(shí)的吸光度A0作為陰性對照。

2.7.3 Fe2+絡(luò)合能力測定

取1 mL 不同質(zhì)量濃度樣品溶液（0～40 mg/mL）與3.7 mL 甲醇和2 mmol/L FeSO4·7H2O 0.1 mL 混合，反應(yīng)30 s 后，加入5 mmol/L 亞鐵嗪0.1 mL，混合均勻后室溫下反應(yīng)10 min，在波長562 nm 處測得樣品吸光度。以樣品本身溶劑為空白樣本，每個(gè)樣品平行3 次，取平均值。

式中：A0為空白樣本吸光度；A樣為樣品吸光度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，見表5。

表5 棕筍中總酚酸類成分的抗氧化活性結(jié)果Table 5 The values of IC50 of extracts from the buds of T.fortunei（mean±SD，n=3）

棕筍總酚酸提取物清除DPPH 的IC50為0.69±0.02，清除DPPH 的IC50為0.56±0.01，絡(luò)合Fe2+的IC50為0.84±0.03，約為維生素C 抗氧化能力的一半，由此可見，其抗氧化能力較強(qiáng)。

3 討論

棕櫚在我國長江以南地區(qū)廣泛栽培，棕櫚既是觀賞植物，又是經(jīng)濟(jì)植物；全身（根、莖、葉、花和種子）都有用，其中含有多種化學(xué)成分，有很高的應(yīng)用價(jià)值。棕苞一般從每年的11月份到次年的3月份可以采摘，剝?nèi)ネ鈱幼仄ぜ纯扇〉?。棕苞味甘微苦，口感較好，具有降血壓和清涼解暑的作用，含有多種氨基酸、淀粉、失水乳糖和蔗糖等，是山珍食譜中的佼佼者。但對于其的開發(fā)利用還不夠。因此，本文通過正交試驗(yàn)，確定了棕筍中總酚酸的最佳提取工藝條件應(yīng)為乙醇濃度50 %、溫度50 ℃、每次提取30 min、提取2 次，其提取率可達(dá)50.79 mg/g。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明，本提取工藝穩(wěn)定可靠，可作為棕筍中酚酸類化合物的提取工藝。

近年來，氧化應(yīng)激給動物細(xì)胞和組織帶來的危害成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，其機(jī)制是氧分子失去了外圍電子形成的自由基會奪取其他細(xì)胞分子的外圍電子，使自身保持穩(wěn)定，造成一種連鎖反應(yīng)，使機(jī)體組織細(xì)胞分子受到損害。因此，研究天然抗氧化物，從根本上預(yù)防自由基氧化損傷迫在眉睫。植物多酚作為新型飼料添加劑成為國內(nèi)外動物營養(yǎng)學(xué)界的一個(gè)研究熱點(diǎn)。植物多酚是廣泛存在于植物體內(nèi)的天然產(chǎn)物，是植物的次生代謝產(chǎn)物，具有獨(dú)特的生理活性和藥用價(jià)值，多酚具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化活性、抗衰老等生物活性功能。酚羥基極易被氧化成為醌類而提供氫，棕筍中具有的多酚類結(jié)構(gòu)化合物中具有連或鄰酚基，作為抗氧化劑其活性高于一般的非酚類或単酚基類抗氧化劑。本實(shí)驗(yàn)所檢測到的沒食子酸、原兒茶酸、原兒茶醛和咖啡酸均為多酚類化合物，因此，棕筍可作為抗氧化劑開發(fā)原料。隨著棕櫚研究的深入，相信棕櫚綜合利用和開發(fā)一定會有很好的廣闊前景。

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