特異性生物芯片在乳品檢測中的應(yīng)用

穆小婷，董文賓，王玲玲，修秀紅

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710021；2.山東福田藥業(yè)有限公司，山東 禹城 251200)

0 引 言

乳及乳制品中所含各種營養(yǎng)元素與人體營養(yǎng)需求相似，易于消化吸收，是人們?nèi)粘２豢扇鄙俚臓I養(yǎng)品之一，但是近年來乳品摻假現(xiàn)象屢禁不止，所以急需尋找一種新型、高效、準(zhǔn)確的乳品安全檢測分析技術(shù)。生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代初期發(fā)展起來的一種全新的微量分析技術(shù)，利用微電子、微機(jī)械、化學(xué)、物理以及計算機(jī)技術(shù)，將生命科學(xué)研究中的樣品檢測、分析過程實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、集成化、微型化，其效率是傳統(tǒng)檢測手段的成百上千倍[1]。生物芯片包含的種類較多，主要有基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片、微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等，其中基因芯片是生物芯片技術(shù)中發(fā)展最成熟以及最先進(jìn)入應(yīng)用和實(shí)現(xiàn)商品化的領(lǐng)域，芯片實(shí)驗(yàn)室是集樣品制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測為一體，實(shí)現(xiàn)生化分析全過程，是生物芯片發(fā)展的最高階段[2-5]。

1 特異性生物芯片技術(shù)在乳品檢測中的應(yīng)用

目前生物芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域，乳及乳制品中成分含量非常復(fù)雜，所以有效地將生物芯片應(yīng)用于牛乳的檢測，將對未來乳品行業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生不可阻擋的動力。文章針對目前國內(nèi)外利用特異性生物芯片檢測乳及乳制品的應(yīng)用情況進(jìn)行了全面綜述，包括在致病微生物、抗生素、毒素、藥物殘留、轉(zhuǎn)基因食品及其他方面的應(yīng)用。

1.1 特異性生物芯片技術(shù)在致病微生物檢測方面的應(yīng)用

牛奶中微生物的含量是評價牛奶質(zhì)量的一個重要指標(biāo),對最終產(chǎn)品質(zhì)量起著關(guān)鍵性的作用。傳統(tǒng)的致病微生物檢測方法主要有平板計數(shù)法和顯微鏡直接觀察法等，它們不僅周期長、操作繁瑣，且靈敏度不高，使得食品的安全檢測存在一定的危險，給消費(fèi)者帶來威脅，現(xiàn)代技術(shù)用的比較多的PCR法比前者快速、靈敏，但成本高，假陽性多，也不是很好的檢測食品微生物污染的方法。而生物芯片技術(shù)由于其具有高通量、高靈敏度和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，可以及時反映食品中微生物的污染情況，獲得了人們的廣泛青睞，它可應(yīng)用于各種導(dǎo)致食品腐敗的致病菌的檢測,能及時、快速、準(zhǔn)確地反映乳品中微生物的污染情況。

近年來，越來越多的研究者開始用生物芯片技術(shù)對食品中常見致病菌進(jìn)行檢測，Cremonesi等[6]根據(jù)連接酶檢測反應(yīng)設(shè)計了一種新的DNA芯片，直接從乳樣品中鑒定能引起牛羊的乳房炎或引起食品中毒的15種細(xì)菌：金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌等，并對50個乳樣品迸行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示出高特異性，靈敏度達(dá)到6 fmol。

YANG L[7]試驗(yàn)了將雙向電泳和固定化生物芯片結(jié)合使用來檢測食源性致病菌，最終證明，這倆種方法的結(jié)合可大大提高生物芯片的免疫捕捉能力和檢測效率。

我國國家生物芯片中心等單位已開發(fā)并生產(chǎn)食源性致病菌檢測、食源性病毒檢測的生物芯片技術(shù)平臺儀器和試劑盒[8]。相信不久的將來，芯片技術(shù)將越來越多地進(jìn)入乳品類食品病原菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)檢測系統(tǒng)的集成化、一體化。

奶牛乳房炎是奶牛三大疾病之一，會嚴(yán)重降低奶牛產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)量，而病原微生物感染是奶牛乳房炎常見的病因，據(jù)大量文獻(xiàn)報道，金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌為引起奶牛乳房炎的主要病原菌。韓旭等[9]全面綜述了PCR、基因芯片和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)在奶牛乳房炎主要病原菌診斷中的應(yīng)用。邢會杰等[10]建立了奶牛乳房炎無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌5種主要致病菌的基因芯片檢測方法，結(jié)果顯示芯片檢測特異性高、檢測的靈敏度為103CFU/mL。

1.2 特異性生物芯片技術(shù)在抗生素檢測方面的應(yīng)用

抗生素殘留不僅影響乳及乳制品的品質(zhì)，而且還會降低產(chǎn)量及破壞后期產(chǎn)品風(fēng)味，給生產(chǎn)者造成經(jīng)濟(jì)損失，且會對人體造成極大的傷害。自2006年7月起國家規(guī)定對所有生鮮牛奶強(qiáng)制檢測抗生素含量，超標(biāo)者不可出售[11]。目前對抗生素的檢測方法主要有理化檢測法，微生物檢測法和免疫檢測法等，儀器檢測法雖然靈敏，但檢測費(fèi)用高，很難普及使用，傳統(tǒng)的微生物檢測方法費(fèi)用低，一般實(shí)驗(yàn)室都能操作，但時間長、易產(chǎn)生誤差、操作復(fù)雜。

Knecht等[12]利用硅烷化修飾的片基制備抗原點(diǎn)陣，自動化分析牛奶中10種抗生素含量，包括β-內(nèi)酰胺類、磺胺類和氨基糖苷類，整個檢測過程自動化，單個組分檢測所用時間不到5 min，10種組分的檢測線在0.12～32 ug之間。

Kloth等[13]建立的間接競爭化學(xué)發(fā)光免疫芯片法，可在幾分鐘內(nèi)同時檢測牛奶中13種抗生素的含量。他們對片基采取了多步化學(xué)處理后，最終在玻片表面修飾上環(huán)氧樹脂活化的PEG層，然后加入磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等的衍生物，直接與環(huán)氧樹脂進(jìn)行共價結(jié)合，無需再加其他偶聯(lián)劑。該方法靈敏度較高，且可重復(fù)使用50次，增加了測定的穩(wěn)定性和便捷性，且減少重新制備片基。

Bang-Ce Y等[14]報道了利用間接競爭熒光免疫蛋白芯片法同時測定牛奶中磺胺二甲嘧啶、鏈霉素，泰樂菌素的含量。結(jié)果顯示3種抗生素的檢測限分別為：3.26 ng/mL（磺胺二甲氧嘧啶），2.01 ng/mL（鏈霉素），637 ng/mL（泰樂菌素），均低于各自的最大殘留量。并對實(shí)際樣品牛奶進(jìn)行了測定，結(jié)果取得了較好的加樣回收率。

左鵬,葉邦策等[15]利用蛋白芯片法快速測定乳品中氯霉素和磺胺二甲嘧啶殘留，并且同現(xiàn)行的免疫學(xué)測定方法進(jìn)行了比較，結(jié)果證明利用蛋白芯片競爭法可以快速準(zhǔn)確測定動物源性食品中氯霉素磺胺二甲嘧啶的殘留。

1.3 特異性生物芯片在毒素檢測方面的應(yīng)用

毒素對人體的健康影響甚大，曾被世界衛(wèi)生組織列為食源性疾病的重要根源。目前常用的乳及乳制品中毒素的檢測方法主要是化學(xué)分析方法、儀器法、免疫學(xué)方法或這些方法的相互結(jié)合等[16]。生物傳感技術(shù)作為一種全新的微量分析技術(shù),將生物技術(shù)和電子技術(shù)相結(jié)合,從而能夠進(jìn)行生命物質(zhì)和化學(xué)物質(zhì)檢測和監(jiān)控的裝置。

早在1996年，高志賢等[17]便采用壓免疫傳感器檢測牛奶中C型葡萄球菌腸毒素,并用多種方法比較電極再生,所制作的壓電免疫傳感器簡單、靈敏,檢測的靈敏度可達(dá)到2.5 μg/L。

Strachan等[18]采用自動免疫傳感器檢測乳酪中的腸毒素等物質(zhì)，結(jié)果證明試驗(yàn)只需要10 min便可出現(xiàn)結(jié)果,檢測最低限為5 ng/g。

Medina等[19]應(yīng)用表面質(zhì)粒共振生物傳感器(SPR)檢測牛奶樣品中的腸毒素B,靈敏度可達(dá)到0.5 ng/mL。SPR檢測的缺陷是只能同時分析幾種物質(zhì)(少于4種)，不能區(qū)分特異的靶物質(zhì)和芯片表面其他樣本的非特異交叉反應(yīng)物，對于固定的受體,當(dāng)其發(fā)生點(diǎn)突變、化學(xué)改變或功能活性改變時,SPR不能將其同完整的分析物加以區(qū)分。

1.4 特異性生物芯片技術(shù)在藥物殘留檢測方面的應(yīng)用

乳品中的藥物殘進(jìn)入人體對人類的健康構(gòu)成潛在的威脅，目前多種藥物殘留可以通過生物芯片技術(shù)進(jìn)行檢測，主要包括磺胺二甲基嘧啶、鏈霉素、恩諾沙星和克倫特羅[20]，具有前處理簡單、靈敏度高、特異性好、檢測速度快、檢測通量高、質(zhì)控體系嚴(yán)密等優(yōu)點(diǎn)。

郭志紅等[21]應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)建立了動物組織中重要獸藥(磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、鹽酸克倫特羅和鏈霉素)的高通量篩選方法，并與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜和微生物檢定法進(jìn)行了比對，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，用蛋白芯片進(jìn)行獸藥殘留檢測的樣品前處理方法簡單、速度快，且用同一種方法提取了多種獸藥，節(jié)省了提取溶劑的用量，在環(huán)保方面也有很大的優(yōu)勢。

陳愛亮等[22]根據(jù)抗原和抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)原理，采用熒光標(biāo)記競爭免疫法，構(gòu)建蛋白芯片測定樣品中的獸藥殘留含量。同時結(jié)合博奧生物有限公司研發(fā)的樣品分子提取儀、芯片掃描儀以及配套的自動化數(shù)據(jù)分析軟件，開發(fā)了晶芯獸藥殘留蛋白芯片檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)可用于豬肉、雞肉、牛奶中磺胺類物質(zhì)、鏈霉素、雙氫鏈霉素、恩諾沙星以及氯霉素的定量檢測。

吳長紅[23]在“2011年第四屆國際食品安全高峰論談?wù)撐募敝幸舶l(fā)表了有關(guān)生物芯片陣列技術(shù)在檢測食品中多種殘留物的文章，包括乳品中磺胺二甲基嘧啶的檢測。

1.5 特異性生物芯片技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品方面的應(yīng)用

自1994年美國第一個轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品——轉(zhuǎn)基因番茄獲得FDA的批準(zhǔn)進(jìn)入市場以來 ,轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物在全球內(nèi)飛速發(fā)展。在乳業(yè)中，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以從微觀的分子水平上認(rèn)識物質(zhì)，進(jìn)行分子操作來生產(chǎn)乳品，這一方面加快了現(xiàn)代乳品加工技術(shù)創(chuàng)造性的融合和發(fā)展，但由于在新產(chǎn)品中導(dǎo)入了外源基因或改變了原有的基因表達(dá)方式，這就涉及到轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題，而基因芯片可以檢測出食品中是否含有轉(zhuǎn)基因,以及含有何種轉(zhuǎn)基因。目前市場上常用的轉(zhuǎn)基因作物檢測方法主要包括PCR檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法 、電泳法、波長色散x射線熒光法、各種雜交法和生物測定檢測法等，但這些方法大多只能對單個檢測目標(biāo)進(jìn)行檢測，且假陽性高，時間周期長，而基因芯片技術(shù)則可以彌補(bǔ)這幾方面的不足[24]。

Deisingh等[25]綜述了食品中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的不同檢測方法，包括PCR法，生物傳感芯片法、商品化試劑盒、電泳法、波長色散x射線熒光法等，芯片法以其高通量、微型化、自動化的特點(diǎn)而占據(jù)著顯著的優(yōu)勢。乳蛋白量和乳脂量作為奶牛生產(chǎn)重要的經(jīng)濟(jì)性狀,可直接影響牛奶的營養(yǎng)、風(fēng)味和牛奶產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張磊[26]選取金華伊康乳業(yè)奶牛場內(nèi)處于干奶期、泌乳前期、泌乳中期以及泌乳后期的中國荷斯坦牛各15頭作為研究對象,分析不同泌乳時期的牛基因組表達(dá)譜的變化情況，選取與奶牛泌乳過程中密切相關(guān)的JAK-STAT信號通路作為研究對象,確定不同泌乳時期該通路內(nèi)基因表達(dá)的變化情況,并根據(jù)各基因的生物學(xué)功能初步確定與泌乳性狀相關(guān)的候選基因，從而為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)乳品奠定了基礎(chǔ)。

1.6 特異性生物芯片技術(shù)在其他方面的應(yīng)用

生物芯片由于其特有的優(yōu)勢，已逐漸應(yīng)用于乳品檢測的各個方面。大家知道牛奶受細(xì)菌作用會產(chǎn)生乳酸,而測定牛奶新鮮度的乳酸傳感器已成為中國微生物傳感器應(yīng)用的基本品種。另外也可從牛奶放置過程中脂解作用產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的含量來判斷牛奶及其制品的新鮮度,這類傳感器也己開發(fā)出來[27]。另外生物芯片也已應(yīng)用于食品毒理學(xué)評價及營養(yǎng)學(xué)評價等，如2008年M.Lefevre等[28]以富含花青素的葡萄為模型，利用基因芯片研究了食品成分與健康食品的作用機(jī)理，并提出了3種新的可以檢驗(yàn)的關(guān)于食品成分和健康食品的作用機(jī)理的假說。雖然到現(xiàn)在為止很多研究沒有直接針對乳及其制品，但是相信隨著生物技術(shù)的不斷成熟，生物芯片技術(shù)必將成為乳及乳制品檢測的重要方法之一。

2 展 望

特異性生物芯片技術(shù)作為一種新型的生物技術(shù)，是一個學(xué)科交叉性很強(qiáng)的研究領(lǐng)域，其巨大的潛力和誘人的商業(yè)前景是有目共睹的，但由于目前的一些技術(shù)難點(diǎn)還沒有完全攻破，如由于污染等原因而影響檢測的靈敏度、提高生物芯片微陣列的密度、簡化樣品制備和標(biāo)記操作等,從而極大限制了市場需求。相信隨著各國研究者的不斷努力,隨著這些技術(shù)的進(jìn)一步完善,基因芯片技術(shù)必將成為21世紀(jì)最具活力的技術(shù)之一，必將受到世界各個國家及其學(xué)術(shù)界的關(guān)注，必將在乳品生產(chǎn)的全程質(zhì)量控制、構(gòu)建有效的乳品安全體系等方面發(fā)揮更大的作用。

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