噬菌體的檢驗程序分析

鄧曉鑫

黑龍江省邊防總隊醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150016

噬菌體的檢驗程序分析

鄧曉鑫

黑龍江省邊防總隊醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150016

噬菌體對相應(yīng)的易感細(xì)菌有強大的溶菌力和具有嚴(yán)格的種及型的特異性，因而可應(yīng)用噬菌體作細(xì)菌的鑒定、分型、檢測標(biāo)本中的未知細(xì)菌和防治某些傳染病。用于結(jié)核病的實驗診斷，尤其是初診患者的鑒別診斷，直接判定患者是否為活動性結(jié)核患者。通過噬菌斑數(shù)量變化，實驗結(jié)果強陽性、弱陽性、陰性的轉(zhuǎn)變來實時監(jiān)控抗癆藥物是否對癥。

噬菌體；檢驗；分析

噬菌體廣泛分布于自然界，凡有細(xì)菌繁殖的地方，都可能有噬菌體存在。噬菌體具有嚴(yán)格寄生性，須在活的易感的細(xì)菌體內(nèi)增殖，并能將菌體裂解。由于對相應(yīng)的易感細(xì)菌有強大的溶菌力和具有嚴(yán)格的種及型的特異性，因而可應(yīng)用噬菌體作細(xì)菌的鑒定、分型、檢測標(biāo)本中的未知細(xì)菌和防治某些傳染病［1］。

1 資料與方法

1.1 一般資料

噬菌體常見于糞便、污水和水中，故可用這些材料做噬菌體分離。

1.1.1 糞便及污水（下水道水） 取糞便約5 g或污水10 ml，加入含有50 ml肉湯三角燒瓶內(nèi)，充分振搖使成乳劑勻液，然后放于37℃溫箱中培養(yǎng)12～14 h，再經(jīng)蔡氏濾菌器過濾，取濾液作噬菌體檢查。將此濾液滴加2～3滴于經(jīng)8～12 h培養(yǎng)的某一種幼齡細(xì)菌（例如痢疾桿菌或傷寒桿菌等）培養(yǎng)液中，再放入37℃溫箱培養(yǎng)4～6 h左右，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變清時，即為溶菌現(xiàn)象，可表明濾液中含有與某一種細(xì)菌（痢疾或傷寒桿菌）相應(yīng)的噬菌體。

1.1.2 水 取水200 ml加入3倍濃縮肉湯100 ml內(nèi)，放于37℃溫箱中培養(yǎng)12～14 h后，其余步驟與上述相同。其他標(biāo)本如膿液等亦可按上方法進(jìn)行噬菌體分離。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的檢定 在瓊脂平板上產(chǎn)生的透明溶菌區(qū)（溶菌斑或蝕斑），或在培養(yǎng)液中形成透明溶菌現(xiàn)象，有可能是同一種細(xì)菌中的幾個不同型別菌株共同作用的結(jié)果。因此，必須對噬菌體進(jìn)行檢定，作法如下：用肉湯將濾液（含噬菌體）作10倍連續(xù)稀釋（從10-1～10-9）；在各管加入適量的已知各型細(xì)菌幼齡培養(yǎng)液，以使稀釋濾液微呈混濁為度；再從各管取出混懸液數(shù)滴于瓊脂平板上；用玻璃涂布棒將菌液均勻涂布；將瓊脂平板置37℃溫箱培養(yǎng)12～24 h；若在某1菌型平板上見有微小、零散的噬斑（或稱蝕斑），其余各型平板無噬斑出現(xiàn)者，則為該菌型的噬菌體（因其具有高度特異性）。

1.2.2 溶菌現(xiàn)象的觀察法與噬菌體的增殖 經(jīng)培養(yǎng)過濾后的濾液，是否含有噬菌體，除了上述觀察培養(yǎng)液外，還可按如下檢查：即取某1種細(xì)菌（例如痢疾桿菌或傷寒桿菌）幼齡肉湯培養(yǎng)液2～3接種環(huán)于瓊脂平板上作劃線接種，待其干燥后，于劃線上滴加濾液于幾個地方，然后置37℃溫箱培養(yǎng)1夜。

2 討論

噬菌體是能侵襲細(xì)菌、真菌、放線菌、螺旋體等微生物的病毒，只能在活的宿主菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，噬菌體的DNA能賦予宿主菌某些生物學(xué)性狀，也能介導(dǎo)宿主菌之間以及宿主菌與噬菌體之間的基因轉(zhuǎn)移。噬菌體寄生有嚴(yán)格的宿主特異性，其特異性取決于噬菌體吸附器官和宿主菌表面受體的分子結(jié)構(gòu)的互補性。

先以特異性噬菌體感染、裂解標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌，再用殺病毒劑清除所有未感染結(jié)核分枝桿菌的噬菌體，而結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)的噬菌體繼續(xù)擴增，進(jìn)而裂解細(xì)胞，釋放噬菌體。裂解釋放的噬菌體感染隨即添加的敏感細(xì)胞，在其胞內(nèi)擴增并裂解敏感細(xì)胞，敏感細(xì)胞菌苔上出現(xiàn)肉眼可見的噬菌斑。如待檢標(biāo)本不含結(jié)核分枝桿菌，噬菌體被殺病毒劑完全清除，故無噬菌體感染敏感細(xì)胞，敏感細(xì)胞菌苔上無噬菌斑出現(xiàn)。

噬菌體法檢測結(jié)核分枝桿菌用于結(jié)核病的實驗診斷，尤其是初診患者的鑒別診斷。由于本方法能快速、準(zhǔn)確地檢出活的結(jié)核分枝桿菌，且適用于包括痰液、胸水、腹水、尿、腦脊液、骨髓在內(nèi)的多種類型標(biāo)本，因此通過本方法檢測結(jié)果可直接判定患者是否為活動性結(jié)核患者，無需進(jìn)一步鑒定［2］。如聯(lián)合涂片法檢查，效果更佳。

［1］朱召芹，闞飆，高守一.噬菌體裂解系統(tǒng)及其相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展［J］.中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2004，5（6）：495-498.

［2］金曉琳，張克斌，胡福泉.噬菌體最佳保存方法探討［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001，23（7）：863-864.

The Analysis of Phage Inspection Program

DENG Xiaoxin Heilongjiang Armed Police Frontier Corps Hospital，Ha’erbin Heilongjiang 150016，China

The phage lyses of corresponding susceptible bacteria has a strong force and has a strict and type of specificity，thus can be used for bacteria identification，classification，detection of unknown bacteria in the sample and some prevention and control of infectious diseases.For TB diagnosis experiment，especially the diagnosis and the differential diagnosis for the primeval patients with directly determine whether the patients are active TB patients.Through the plaque quantity change，the experimental results present the strong positive，weakly positive or negative shift to make sure whether the real-time monitoring and the chemotherapy drugs suit.

Phage，Inspection，Analysis

S132

B

1674-9316（2014）21-0125-02

10.3969/J.ISSN.1674-9316.2014.21.077