廣東梅縣一野生紅菇化學(xué)成分及急性毒性研究

徐紹業(yè)，金美華，趙靈穎，李晶晶，韋玉，蔣禎鳳，羅琴，陳新華

（桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541004）

紅菇屬（Russula Pers.）是一類具有重要經(jīng)濟意義的真菌類群，在中國有非常廣泛的分布。紅菇屬真菌多數(shù)可食用，是美味的食用菌，如變綠紅菇，梨菇；也有一些種類有毒[1-2]，如亞稀褶紅菇，嘔吐紅菇，脆弱紅菇，點柄黃紅菇等，誤食后往往引起胃腸炎型中毒癥狀，其中亞稀褶紅菇為劇毒的品種，誤食中毒發(fā)病率70%以上，半小時后發(fā)生嘔吐等，死亡率可達(dá)70 %。

廣東梅縣地處熱帶亞熱帶地區(qū)，山地眾多，野生大型真菌資源十分豐富。作者在廣東梅縣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有兩種類紅菇形態(tài)和顏色都十分相似，一為當(dāng)?shù)厝罕姺Q為的“紅菌”或“紅菇”，已成為商品紅菇；另一為“棺材菌”或“白菌”，當(dāng)?shù)卮迕癫徊烧纹渥陨詼?。目前，關(guān)于該“棺材菌”的毒性及化學(xué)成分鮮見有文獻(xiàn)報道。因此，我們對廣東梅縣“棺材菌”進(jìn)行了急性毒性和化學(xué)成分類型研究，為進(jìn)一步研究和利用該野生紅菇資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 儀器與試劑

儀器：電爐，冷凝管，鐵架臺。電子天平FA2204B：上海精科天美科學(xué)有限公司；三用紫外線分析儀ZF-6型：上海嘉鵬科技有限公司；循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

試劑：乙醇、石油醚、氯仿、茚三酮、濃鹽酸、濃硫酸、α-萘酚、鎂粉、碘、氯化汞、醋酐、對硝基苯胺、醋酸鎂、亞硝酰鐵氰化鈉、冰醋酸、無水硫酸鈉、氫氧化鈉、氨水、溴甲酚綠、碘化鉀、3，5-二硝基苯甲酸、氫氧化鈉、正丁醇、冰醋酸、硼酸、30%過氧化鈉、三氯化鋁、三氯化鐵、異羥肟酸鐵、明膠、氯化鈉均為分析純試劑；硫酸銅、酒石酸鉀鈉為化學(xué)純試劑；水為蒸餾水。

1.1.3 材料

實驗動物：KM 小鼠，體重（20±2）g，雌雄各半，購于桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK 桂2007-0001。

紅菇樣品：同一時間采集于廣東梅縣隆文鎮(zhèn)村東一個山頭，采回的子實體洗去泥土經(jīng)60 ℃烘干至恒重后，用植物粉碎機粉碎，過40 目篩，放入干燥器中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 化學(xué)成分鑒別

1.2.1 供試樣品的制備

水提取液：稱取樣品粗粉5 g，置于100 mL 的三角燒瓶中，加蒸餾水50 mL 室溫浸泡過夜。過濾出約20 mL 濾液供檢查氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)備用。

熱水提取液：將上述剩余的冷水浸泡液連同濾渣于水浴上60 ℃左右熱浸30 min，趁熱過濾，濾液供檢查糖、多糖、有機酸、皂甙、甙類、酚類、鞣質(zhì)等成分備用。

乙醇提取液：稱取樣品粗粉10 g，置于250 mL 圓底燒瓶中，加95%乙醇100 mL，于水浴上加熱回流1 h，過濾，濾液供檢查黃酮、蒽醌、香豆素、萜類、甾體、強心甙、有機酸、酚類、鞣質(zhì)等成分備用。

酸性乙醇提取液：稱取樣品粗粉1 g，加0.5%硫酸的乙醇溶液10 mL，于水浴上加熱回流10 min，過濾，濾液供檢查生物堿備用。

石油醚提取液：稱取樣品粗粉1 g，加入石油醚（60 ℃～90 ℃）10 mL，濾液供檢查揮發(fā)油、油脂、萜類、甾體化合物等成分備用。

1.2.2 化學(xué)成分鑒定方法

用加熱沉淀實驗、茚三酮實驗和雙縮脲實驗檢測氨基酸和蛋白質(zhì)；泡沫實驗和醋酐-濃硫酸檢測皂苷；Fehling 反應(yīng)和Molish 反應(yīng)檢測多糖；三氯化鐵實驗和氯化鈉-明膠反應(yīng)檢測酚類或鞣質(zhì)類；pH 試紙和溴甲酚綠實驗檢測有機酸；碘化汞鉀實驗、碘-碘化鉀實驗和苦味酸實驗檢測生物堿；堿性反應(yīng)、醋酸鎂反應(yīng)和硼酸試驗測定蒽醌類；熒光實驗、重氮化反應(yīng)和異羥肟酸鐵反應(yīng)檢測內(nèi)酯和香豆素；堿性苦味酸反應(yīng)、3，5-二硝基苯甲酸反應(yīng)和亞硝酸鐵氰化鈉反應(yīng)檢查強心甙類；氯仿-濃硫酸反應(yīng)和醋酐-濃硫酸反應(yīng)檢測甾體；油斑實驗檢測揮發(fā)油及油脂；鹽酸-鎂粉反應(yīng)、三氯化鋁熒光實驗和氨熏實驗檢測黃酮類物質(zhì)。

1.3 急性毒性試驗

試驗時將紅菇粉末用蒸餾水配成注射器能抽動的混懸液，最大濃度為0.25 g/mL，用時搖勻。具體參考GB1519·3—2003《食品急性毒性試驗》。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，實驗組以最大給藥濃度（0.25 g/mL）灌胃，三次灌胃間隔時間4 h，染毒容量為0.20 mL/10 g，折合成紅菇粉末給予量為15.00 g（/kg/d）。動物實驗小鼠20 只，禁食不禁水16 h，分實驗組與對照兩組，每組10 只，雌雄各半。對照組灌胃以蒸餾水，時間及劑量相同。染毒3h～4h后恢復(fù)正常進(jìn)食。染毒后注意觀察小鼠中毒表現(xiàn)、死亡數(shù)和死亡時間。記錄染毒時、染毒后第7 天和第14天的體重。觀察期結(jié)束后，脫臼處死小鼠并解剖觀察主要臟器和組織有無肉眼可見的病理學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用origin75 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計，各組數(shù)據(jù)以x±s表示，各組均數(shù)間差異采用方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)成分分析結(jié)果

通過化學(xué)成分預(yù)試驗，結(jié)果表明該菇中可能含有氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、還原糖、多糖及糖苷類、有機酸、植物甾醇、皂苷、三萜類、生物堿類等化學(xué)成分。

2.2 對小鼠一般體征的影響

實驗組小鼠分別灌胃給予紅菇粉末后，小鼠活動正常，連續(xù)觀察14 d，所有受試小鼠毛色光潔，飲食、活動和大小便正常，鼻、眼和口腔無異常分泌物，未出現(xiàn)不良情況。

2.3 對小鼠給藥前后體重的影響

第1 天受試樣品組雌性小鼠平均體重為（22.00±1.87）g，第7 天受試樣品組雌性小鼠平均體重為（27.80±2.05）g，7 d 內(nèi)受試樣品組雌性小鼠體重增加了5.80 g，第14 天受試樣品組雌性小鼠平均體重為（31.80±2.68）g，14 d 內(nèi)受試樣品組雌性小鼠體重增加了11.20 g。

第1 天受試樣品組雄性小鼠平均體重為（24.20±1.48）g，第7 天受試樣品組雄性小鼠平均體重為（32.40±1.52）g，7 d 內(nèi)受試樣品組雄性小鼠體重增加了8.20 g，第14 天受試樣品組雄性小鼠平均體重為（38.40±1.34）g，14 d 內(nèi)受試樣品組雄性小鼠體重增加了14.20 g。

受試樣品組雌、雄小鼠體重與對照組無明顯差別，14 d 內(nèi)動物生長情況良好，表明紅菇樣品對小鼠體重?zé)o明顯影響。結(jié)果見表1。

表1 廣東梅縣一野生紅菇對動物體重的影響（x±s）Table1 Effects of wild Russula sp.from Meixian county，Guangdong on the body weight of mouse

2.4 小鼠死亡狀況

小鼠經(jīng)口灌胃給予受試紅菇樣品15.00 g/kg 小鼠體重劑量，整個試驗期14 d 內(nèi)無動物死亡發(fā)生，受試樣品組10 只小鼠全部存活。

2.5 對主要臟器的影響

脫臼處死所有受試小鼠進(jìn)行大體解剖，未見其組織器官出現(xiàn)顏色、體積和質(zhì)地等改變。受試樣品組小鼠皮膚、黏膜、眼睛、呼吸、循環(huán)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、行為表現(xiàn)等反應(yīng)與對照組小鼠無明顯差別。

3 結(jié)論與討論

以紅菇樣品最大使用濃度給予KM 小鼠經(jīng)口灌胃劑量為15.00 g/kg 小鼠體重，在觀察期內(nèi)受試樣品組小鼠毛色，皮膚，黏膜，眼睛，呼吸，循環(huán)，自主活動及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、行為表現(xiàn)等均對照組小鼠無明顯差別，整個試驗期內(nèi)無小鼠死亡發(fā)生，紅菇樣品對雌性和雄性小鼠的半數(shù)致死量（LD50）均大于15.00 g/kg 體重。根據(jù)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，該野生紅菇樣品屬無毒級[3]。對所有試驗小鼠進(jìn)行大體解剖，組織器官未見有異常改變。本試驗結(jié)果表明受試紅菇樣品急性毒性很小，但急性毒性實驗僅數(shù)次給藥，觀察時間較短，故還應(yīng)結(jié)合長期毒性試驗的毒性表現(xiàn)及多種檢查結(jié)果綜合分析評價其毒性。

同時，本實驗還對該菇子實體的化學(xué)成分進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菇子實體中含有大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)（氨基酸）和多糖，小分子物質(zhì)黃酮類、生物堿、酚類、甾體、萜類和有機酸等。該紅菇為紅色，試驗表明紅色素屬水溶性色素。由于預(yù)試樣液本身就帶有一定顏色，故用活性炭去色素以免造成顏色變化不明顯或出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。大型真菌種類不同其化學(xué)成分存在差異，還可能發(fā)現(xiàn)新化合物類型，該菇具體化學(xué)成分和生物活性還需進(jìn)一步研究。

[1] 卯曉嵐.中國經(jīng)濟真菌[M].北京：科學(xué)出版社,1998:1-762

[2] 應(yīng)建浙,卯曉嵐,馬啟明,等.中國藥用真菌圖鑒[M].北京：科學(xué)出版社,1987:1-579

[3] 戴寅,馬鳳樓,郭世萍.急性毒性試驗(GB 15193.3—2003).食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法[M].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004:29