腎小管上皮細胞凋亡與腎纖維化及中藥組分的干預進展

顧 銅 李 均

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)研究生院，廣州 珠海 519000)

中藥組分可以通過抑制腎小管上皮細胞凋亡相關發(fā)生機制，進而延緩腎纖維化。目前學界對于腎小管上皮細胞凋亡與腎纖維化及中藥組分的干預的研究比較多，本文從腎小管上皮細胞的凋亡發(fā)生機制、腎纖維化發(fā)病機制以及中藥組分通過抑制腎小管上皮細胞凋亡相關途徑，進而延緩腎纖維化三個方面進行綜述。

1 腎小管上皮細胞凋亡相關發(fā)生機制

1.1觸發(fā)腎小管上皮細胞凋亡的因素 各種觸發(fā)細胞凋亡的因素均能觸發(fā)腎小管上皮細胞凋亡，原因主要有：腎臟因子相對缺乏、生理性觸發(fā)因素、細胞黏附能力下降以及細胞毒刺激〔1〕。在缺血、中毒介導的急性腎衰(ARF)中，局部、階段性腎小管壞死并不能引起腎小球濾過率(GFR)的顯著下降，而缺血、中毒刺激導致的非致命性損害在其中起到很大作用，這種非致命性損害可致腎小管上皮細胞極性喪失及單向離子轉(zhuǎn)運功能受損，細胞與細胞間、細胞與細胞基質(zhì)間黏附能力下降，進一步細胞凋亡，腎小管上皮細胞脫落，在管腔內(nèi)形成管型，腎小管梗阻、GFR下降。當致病因素去除后，腎小管上皮細胞可完全恢復正常〔2〕。ARF動物模型，表皮生長因子EGF產(chǎn)生明顯下降，伴隨嚴重的腎小管上皮細胞損傷，此時若給予外源性(EGF)、胰島素樣生長因子(IGFs)、肝細胞生長因子(HGF)有利于其恢復〔3〕。推測生長因子一方面可通過促進殘余腎小管上皮細胞增生，另一方面可能通過抑制細胞凋亡，減輕各種刺激對腎小管上皮細胞的損害〔4〕。新近研究也證實，無論是在ARF還是在慢性腎小管間質(zhì)病變中，多種生理因素觸發(fā)的細胞凋亡在腎小管上皮細胞損傷中都起重要作用〔5〕。

1.2腎纖維化的發(fā)生機制 一般情況下，凋亡的細胞被吞噬，若凋亡細胞沒有被及時清除，可進一步降解，細胞膜完整性喪失，乳酸脫氫酶(LDH)釋放，即所謂的繼發(fā)性壞死〔6〕。與原發(fā)性壞死不同的是其細胞核仍呈現(xiàn)細胞凋亡的特征性改變，染色體濃縮與碎裂。體內(nèi)繼發(fā)性壞死極其少見，主要見于凋亡細胞突出于管腔(如胃腸道、腎小管)或大量細胞凋亡已超過組織的吞噬能力〔7〕。腎小管上皮細胞的凋亡與腎小管上皮細胞的轉(zhuǎn)分化分不開，在間質(zhì)纖維化的進展過程中，腎小管隨著纖維化的進程可肥大或萎縮，從而導致腎小管上皮細胞的凋亡〔8〕。

腎臟纖維化包括腎小球硬化與腎間質(zhì)纖維化(RIF)，RIF導致腎臟損害進行性發(fā)展，幾乎是所有腎臟疾病進展至終末期腎衰的共同途徑，腎臟疾病的預后更多的與腎纖維化受累的程度密切相關〔9〕。目前認為，腎纖維化的發(fā)病機制主要是細胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生與降解失衡以及成纖維細胞的增生腎纖維化的發(fā)生大致可分為三個階段，第一階段為誘導階段，主要表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤、致纖維化細胞因子釋放以及成纖維細胞活化；第二階段為炎癥基質(zhì)合成階段，表現(xiàn)為大量ECM產(chǎn)生與沉積以及致纖維化細胞因子進一步釋放；第三階段為炎癥后基質(zhì)合成階段，在這一階段中，仍有致纖維化細胞因子不斷產(chǎn)生，成纖維細胞繼續(xù)增殖〔10〕。腎小管間質(zhì)細胞的活化、炎癥細胞浸潤、血管活性物質(zhì)導致纖維化細胞因子過度表達等因素，在RIF發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用〔11〕。Lim等〔12〕在研究缺氧對腎小管上皮細胞的轉(zhuǎn)分化作用時發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞和間質(zhì)成纖維細胞可向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化，參與RIF的發(fā)展。Wagener等〔13〕提出RIF的發(fā)病機制，不僅與成纖維細胞的過度生長有關，而且也與凋亡減少關系密切。

2 中藥組分對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑的調(diào)節(jié)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是近年來發(fā)現(xiàn)的獨立于死亡受體信號途徑和線粒體損傷途徑以外的一種新的細胞凋亡途徑。例如，半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)作為一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜的蛋白,在死亡受體或者線粒體調(diào)亡途徑中不被活化。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的過程中，Caspase-12酶原被激活為Caspase-12，活化的Caspase-12切割并且激活Caspase-9，活化的Caspase-9裂解Caspase-3酶原等效應Caspase,誘導細胞調(diào)亡。因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激能觸發(fā)由Caspase-12、9、3而非線粒體依賴的特異級聯(lián)反應，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、折疊和運輸及細胞鈣離子儲存的主要場所〔14,15〕。許多環(huán)境因素或細胞內(nèi)因素，例如重要組分等都可導致細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，直接或間接引起大量未折疊或者錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蓄積，導致細胞處于應激狀態(tài)并啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號轉(zhuǎn)導通路〔16〕。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，參與蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的糖基化修飾，對蛋白質(zhì)的折疊、裝配和運輸具有重要的作用，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的關鍵調(diào)節(jié)蛋白，同時也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志性蛋白。生理狀態(tài)下，GRP78與3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激感受蛋白結合，低水平表達，當未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蓄積時，GRP78與3種感受蛋白解離，啟動未折疊蛋白質(zhì)反應(UPR)，UPR最基本的效應是促進細胞適應環(huán)境的變化并重建正常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。然而在過激的或者持續(xù)的刺激下，細胞適應性反應失控將誘導細胞凋亡〔17〕。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可通過多條途徑引起細胞凋亡。其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子(CHOP)，激活被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激促發(fā)細胞凋亡最重要的信號途徑〔18〕。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導凋亡的關鍵執(zhí)行者〔19〕。

中藥組分可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑、抗氧化、抑制凋亡相關蛋白Caspase-3、GRP78等表達，抑制腎小管凋亡的發(fā)生，進而抗腎纖維化。銀杏葉提取物(EGB)是從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)，其有效成分主要是黃酮苷類和萜類〔14〕。國內(nèi)外的一些研究表明,EGB中所含的黃酮化合物具有明顯的抗氧化和抗自由基活性，其分子中含有還原性羥基功能基團，可直接發(fā)揮抗氧化作用，EGB可以顯著抑制抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導的人腎小管上皮細胞凋亡，其機制除了與其上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達和下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達有關外，可能還與它的抗氧化活性和抗自由基活性密切相關。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的過程中，冬蟲夏草干預鏈脲佐菌素(STZ)誘導形成的糖尿病腎病模型大鼠，能明顯減少大鼠的24 h尿蛋白排泄量，延緩血清肌配升高，減輕搪尿病腎病的腎臟病理改變；糾正其血脂代謝異常、降低血中Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)的水平，并能使腎組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、結締組織生長因子(CTGF)、Col Ⅳ蛋白及原癌基因c-myc表達下調(diào)，具有良好的腎保護作用〔20〕。蟲草能減少尿蛋白排泄，降低腎組織Ⅳ型膠原及表達，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、MMP抑制因子平衡，減輕腎小球ECM的積聚，延緩腎小球硬化的進展。冬蟲夏草還可通過下調(diào)TGF-β1、Col-Ⅳ的表達，抑制腎小管上皮細胞、成纖維細胞轉(zhuǎn)化為成肌纖維細胞，防治RIF。

3 中藥組分對炎癥細胞趨化因子分泌的抑制

在腎小管的管腔面，細胞主要受到來自小管液中過量的尿蛋白、葡萄糖、腎毒性物質(zhì)、一些多膚類生長因子及活性氧等因素的刺激；在基膜面主要受到來自血液及腎間質(zhì)中的單核巨噬細胞、血小板等產(chǎn)生的炎癥因子刺激〔21〕。在這些刺激因素作用下，腎小管上皮細胞可被誘導凋亡。在RIF的過程中有大量腎臟細胞的凋亡，其中腎小管上皮細胞高表達FaS/FaSL、細胞內(nèi)Bc12與Bax比值失調(diào)與其凋亡發(fā)生有關，而腎小管上皮細胞的過度凋亡可能是腎小管萎縮的原因，并參與了RIF的發(fā)生機制；或被活化，通過分泌趨化因子如炎癥細胞趨化因子重組人趨化因子配體5(CCL5)和趨化因子配體10(CXCL10)等，吸引炎癥細胞，參與早期的炎癥過程〔22〕。

腎間質(zhì)炎性反應是慢性腎臟疾病進展的一個重要因素，炎性反應程度與RIF程度直接相關。炎性浸潤在間質(zhì)纖維化早期即發(fā)生并貫穿整個纖維化病變過程中〔23〕。腎小管上皮細胞RTEC)是重要的間質(zhì)炎性反應激活劑，是產(chǎn)生炎性反應介質(zhì)的主要細胞。RTEC損傷后分泌單核細胞趨化蛋白(MCP-1)、受激活調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌因子(RANTES)明顯增多，被循環(huán)的單核巨噬細胞和淋巴細胞膜上的趨化因子受體識別，誘導其向間質(zhì)遷移并活化。活化的炎性反應細胞分泌大量細胞因子、炎性反應介質(zhì)和自由基，進一步損傷小管，誘導更多的炎性反應細胞浸潤，加速RIF。浸潤的炎性反應細胞加快腎臟纖維化形成和腎功能喪失，其主要機制：(1)炎性反應細胞分泌合成ECM，直接引起腎間質(zhì)基質(zhì)聚集。(2)單核巨噬細胞是產(chǎn)生促纖維化因子如TGF-β1、重組牛堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血小板源性生長因子(PDGF)的重要細胞。(3)炎性反應細胞浸潤又可進一步誘發(fā)RTEC釋放更多化學趨化因子，誘導更多炎性反應細胞浸潤，產(chǎn)生炎性反應因子，損傷腎組織。(4)炎性反應細胞誘導小管細胞肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化(EMT)，并促進其分泌ECM，從而促進間質(zhì)纖維化。(5)巨噬細胞產(chǎn)生無數(shù)的促凋亡介質(zhì)如TNF、Fas/FasL殺死鄰近細胞，誘導免疫性和非免疫性間質(zhì)炎性反應中RTEC凋亡，導致小管萎縮。(6)纖維蛋白溶酶陽性的肥大細胞浸潤數(shù)量與RIF程度有關〔24〕。

冬蟲夏草(百令)及其提取液，銀杏葉中提取的活性物質(zhì)等能減少腎小管上皮細胞空泡變性和細胞壞死，減少間質(zhì)炎細胞浸潤及間質(zhì)纖維化，降低小血管的透明樣變性的發(fā)生率；同時也抑制TGF p在小血管的表達，減少纖維連接蛋白在球囊壁和血管的沉積。冬蟲夏草可以促進體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞增生，對環(huán)孢素A(CsA)的腎小管細胞毒性具有一定的拮抗作用，在腎臟疾病中，通過阻斷成纖維細胞的活化而抑制炎癥反應〔25〕。經(jīng)白細胞介素1(IL-1)受體拮抗劑或抗細胞間黏附因子-1(ICAM-1)抗體預處理后，能保護大鼠腎臟防止抗腎小球基底膜腎病動物模型的纖維化進一步發(fā)展〔26〕。高血壓造成嚴重的腎臟損害時，腎組織可出現(xiàn)ICAM-1和血管細胞黏附分子1(VCAM-1)的異常表達，酶抑制劑(ACEI)與一些中藥組分可通過改變二者在腎組織中的表達狀況而有效保護腎功能，延緩腎纖維化的進展。

4 中藥組分抑制腎小管上皮細胞凋亡的其他途徑

近年來，中醫(yī)藥通過抑制腎纖維化過程中 EMT發(fā)生的研究較多，主要采用中藥單體、經(jīng)典方劑、經(jīng)驗復方制劑等進行實驗研究〔27〕。在內(nèi)科，黃芪注射液與丹參注射液經(jīng)常單獨或聯(lián)合應用防治腎纖維化的發(fā)生發(fā)展，但未見黃芪丹參有效組分不同比例配伍干預單側輸尿管梗阻大鼠腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化作用的相關研究。僅見趙松等〔28〕采用黃芪當歸合劑，樸勝華等〔29〕采用黃芪、三七不同劑量配伍的通脈口服液進行腎纖維化治療的相關研究。黃芪丹參配伍能針對腎纖維化病機脾腎氣虛、淤血阻絡而發(fā)揮補氣活血之功效。李均等〔30〕認為黃芪丹參藥及其有效組分不同劑量配伍對對側輸尿管梗阻大鼠腎纖維化模型具有緩解作用，以組分配伍1∶1組效果最為明顯。該組配伍能顯著降低α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)在腎間質(zhì)表達的陽性率，同時也能上調(diào)上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達，說明該組分配伍具有良好的抑制腎小管上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的效果，通過抑制腎小管上皮細胞的轉(zhuǎn)分化，從而抑制腎小管細胞的凋亡。

Wang等〔31〕在總結腎小球疾病引起腎小管間質(zhì)損傷的各種可能途徑時指出，腎小球通透性的損傷導致一些物質(zhì)進入腎小管腔，而這些物質(zhì)對腎小管具有毒性，從而引起一系列的最終導致腎小球硬化的適應性改變。原始腎小球損傷引起腎小管間質(zhì)的損傷，而腎小管間質(zhì)的因素又不可避免地進展，導致腎小球的功能進一步降低，并造成腎間質(zhì)的進一步損傷，如此循環(huán)，最終腎小球疾病進展至慢性過程。中藥組分例如冬蟲夏草等，可通過下調(diào)TGF-β1、α-SMA、Ⅳ型膠原的表達，抑制腎小管上皮細胞、成纖維細胞轉(zhuǎn)化為成肌纖維細胞，防治RIF。體外研究還表明，蟲草可抑制低密度脂蛋白引起的人系膜細胞增殖；抑制2型糖尿病腎病大鼠腎組織細胞凋亡發(fā)生，從而減少糖尿病RIF的發(fā)生，還能使馬兜鈴酸鈉鹽刺激的人近端腎小管上皮細胞促ECM的合成因子TGF-β1、CTGF及抗ECM降解因子人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)、纖溶酶原激活劑抑制物1(PAI-1)的表達下調(diào)，改善馬兜鈴酸腎病的RIF及腎功能。

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