陳章洲 徐仁伵
(吉安市泰和縣人民醫(yī)院內(nèi)科,江西 泰和 343700)
肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是一種進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病,由于上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性導(dǎo)致延髓、四肢、軀干等部位肌肉逐漸無(wú)力和萎縮,確診后3~5年患者多因呼吸肌麻痹而死亡,目前尚無(wú)有效的治療方法。利魯唑(riluzole)為谷氨酸拮抗劑,可使ALS患者的生存期平均延長(zhǎng)3 個(gè)月以上,是目前唯一被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)的臨床藥物。其他的治療措施還包括維生素、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及干細(xì)胞移植等,但都沒(méi)有確切效果?;蛑委煘橹委烝LS提供新的治療策略。
雖然ALS有特定的致病基因,但其發(fā)病仍與多種因素的互相影響有關(guān)。大約20%的家族遺傳性ALS(fALS)與銅/鋅超氧化物歧化酶-1(SOD1)基因突變有關(guān),約5%與編碼TDP-43蛋白的TAR DNA結(jié)合蛋白(TARDBP)基因突變有關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)了更多與ALS患者相關(guān)的基因突變,如血管生成素(ANG)基因、囊泡相關(guān)膜蛋白相關(guān)蛋白B(VAPB)基因和脂肪肉瘤融合(FUS/TLS)基因〔1,2〕。不論散發(fā)性ALS(sALS)是否存在上述基因突變,但都有共同的病理特征,即運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性死亡、氧化應(yīng)激、神經(jīng)纖維異常、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙、軸突運(yùn)輸障礙、RNA結(jié)合蛋白的基因突變和炎癥因素都在ALS發(fā)病過(guò)程中起到作用。近年來(lái),由于神經(jīng)遺傳學(xué)研究的進(jìn)展,ALS發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步闡明,導(dǎo)入外源性基因載體的改進(jìn)及其基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的進(jìn)步,使基因介導(dǎo)的治療正逐步實(shí)現(xiàn)。
2.1星形膠質(zhì)細(xì)胞 盡管在ALS中選擇性易損細(xì)胞為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞,但星形膠質(zhì)細(xì)胞可激發(fā)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡及炎癥反應(yīng)〔3~5〕,在疾病的發(fā)展過(guò)程中也起到調(diào)節(jié)作用。降低星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體水平可以導(dǎo)致ALS患者谷氨酸攝取障礙及繼發(fā)的興奮性毒性作用。興奮性氨基酸受體(EAAT2)主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞,而EAAT2被抑制則是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞興奮性毒性的一個(gè)原因。在體外培養(yǎng)的研究中,大量表達(dá)EAAT2可以顯著增加谷氨酸的攝取率及提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)保護(hù)作用。SOD1小鼠的EAAT2增加可延緩其運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的丟失,若受體減少則在早期即表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的丟失〔6〕。由此可見(jiàn)增加膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸受體的表達(dá)有助于ALS的治療。盡管此結(jié)論在目前基因治療領(lǐng)域并未應(yīng)用,但通過(guò)在病灶區(qū)增加正常星形膠質(zhì)細(xì)胞以清除過(guò)量谷氨酸的細(xì)胞治療方式已被推薦〔7〕。
2.2神經(jīng)肌肉接頭 因?yàn)榻K板的失神經(jīng)支配為ALS的最初變化之一〔8〕,在早期即著眼于神經(jīng)肌肉接頭則成為保證運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元間聯(lián)系的重要方式〔9,10〕。對(duì)初生的SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠肌內(nèi)注射以腺病毒為載體整合的心肌營(yíng)養(yǎng)因子-1,可延緩神經(jīng)肌肉變性。同樣體外神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)的肌肉注射,在SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠疾病中期階段亦可增加神經(jīng)肌肉連接和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量〔11〕。近期有研究證明對(duì)初生轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行全身肌肉注射表達(dá)抗SOD1的腺病毒相關(guān)載體AAV6,可阻止肌肉萎縮但不能阻斷疾病的進(jìn)展〔12〕。
綜上所述,對(duì)于ALS要同時(shí)針對(duì)脊髓(如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞)和骨骼肌(如神經(jīng)肌肉接頭)進(jìn)行治療才有可能更全面得阻止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性。
目前以嚙齒類動(dòng)物為模型的研究已廣泛開(kāi)展,雖然已有可延長(zhǎng)動(dòng)物存活期及阻止神經(jīng)元丟失的報(bào)道,但治療與動(dòng)物模型的相關(guān)性仍存置疑,因?yàn)榻^大多數(shù)干預(yù)都在動(dòng)物發(fā)病以前進(jìn)行,而ALS患者卻已有明確臨床表現(xiàn)。除了現(xiàn)已熟悉的SOD轉(zhuǎn)基因小鼠,動(dòng)物模型也需要多元化。目前已有以豬作為SOD轉(zhuǎn)基因的大動(dòng)物模型,另也存在類似于ALS患者延髓麻痹的自發(fā)性喉部麻痹的犬類〔13〕及存在SOD1基因錯(cuò)義突變的脊髓變性犬類亦可作為ALS可能的大動(dòng)物模型,這些多元化的動(dòng)物模型有利于進(jìn)行ALS包括基因治療的在內(nèi)的各項(xiàng)研究。
基因治療的途徑分為體外細(xì)胞介導(dǎo)法(ex vivo)和體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染法(in vivo)。ex vivo是指將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體自身或異體細(xì)胞(或異種細(xì)胞),經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增后,輸回人體,此途徑比較經(jīng)典、安全,而且效果較易控制,但是步驟多、技術(shù)復(fù)雜、難度大,不容易推廣;in vivo 途徑是將外源基因裝配于特定的真核細(xì)胞表達(dá)載體,直接導(dǎo)入體內(nèi)。這種載體可以是病毒型或非病毒性,甚至是裸DNA。此途徑操作簡(jiǎn)便,容易推廣,但目前尚未成熟,存在療效持續(xù)時(shí)間短,免疫排斥及安全性等一系列問(wèn)題。
ALS基因治療的療效與以何種方式將轉(zhuǎn)基因物質(zhì)充分轉(zhuǎn)染運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞直接相關(guān),而且其組織內(nèi)分布的彌散程度也決定了可能達(dá)到的最佳療效。事實(shí)上,在ALS基因治療的臨床實(shí)踐中,以何種途徑可以將安全有效的基因轉(zhuǎn)遞至脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,且呈彌散性分布,仍是一極大的挑戰(zhàn)。
近年來(lái)已有不少有關(guān)于ALS基因治療給藥途徑的研究。但在鼠類行之有效的非侵入性肌肉注射和神經(jīng)內(nèi)注射在大動(dòng)物模型中并未得到放大驗(yàn)證,這可能與轉(zhuǎn)運(yùn)載體無(wú)效和基因在脊髓的表達(dá)有限相關(guān)。目前已有研究證明對(duì)猴子行肌肉注射AAV6介導(dǎo)的基因后可得到大量的表達(dá)〔14〕,但對(duì)已累及遠(yuǎn)端軸索的患者是否可行仍待考究。另外可將基因更直接地轉(zhuǎn)移至脊髓的椎管內(nèi)注射,雖然在野生型SOD1動(dòng)物中已卓有成效〔15,16〕,但尚未得到臨床驗(yàn)證。有學(xué)者正在對(duì)ALS患者椎管內(nèi)注射進(jìn)行1期臨床研究,不過(guò)安全性問(wèn)題仍阻礙了其發(fā)展〔17〕。因肌肉、神經(jīng)、椎管內(nèi)注射途徑均不能將基因轉(zhuǎn)移至整個(gè)脊髓,僅僅可作為局限性基因傳遞方式。
當(dāng)前ALS基因治療的研究主要集中在以腺病毒為載體的AAV9,它可經(jīng)靜脈或鞘內(nèi)注射通過(guò)血腦屏障且對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有一定的選擇性〔18~20〕。另外還有一些學(xué)者〔18,21~23〕在大動(dòng)物模型中研究以這種載體及其彌漫性非侵入性注射后的基因表達(dá)情況。
5.1神經(jīng)保護(hù)作用 目前已證實(shí)對(duì)嚙齒類ALS動(dòng)物模型中瀕死運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)可延長(zhǎng)其存活期,這也是有關(guān)ALS治療研究的前提。但對(duì)于ALS患者進(jìn)行全身注射腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)或類胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1卻無(wú)獲益〔24,25〕??赡芘c注射的不恰當(dāng)或不足量致其失活或縮短其半衰期有關(guān)。但以基因轉(zhuǎn)染方式給予神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子則是更有效的方法。
5.2病毒載體轉(zhuǎn)運(yùn)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、IGF-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等 AAV和慢病毒載體能作用于非分裂相細(xì)胞,而且能與宿主細(xì)胞基因組發(fā)生整合。以病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病的潛在治療方案,目前已有學(xué)者〔26~28〕在對(duì)帕金森病及阿爾茨海默病進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn),以評(píng)估此方式轉(zhuǎn)遞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的安全性及治療前景。動(dòng)物模型中分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可保護(hù)疾病狀態(tài)下的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞并延緩病程發(fā)展的大量論證是對(duì)ALS患者以基因方式轉(zhuǎn)染神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行治療的理論基礎(chǔ)。在sALS嚙齒類動(dòng)物模型中有大量成功的案例證明病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染GDNF、IGF-1和VEGF對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有保護(hù)作用。這些SOD1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的性狀與ALS患者的臨床表現(xiàn)類似。而用以轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)SOD1鼠起病時(shí)期及病程進(jìn)展的推遲程度,或多或少與其給藥途徑有關(guān)。
研究表明,發(fā)育及成熟運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元對(duì)BDNF、人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NT)-3、NT-4/5有反應(yīng),BDNF、NT-3增加培養(yǎng)胎大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的活性,BDNF可防止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的自然死亡,并對(duì)損傷的新生大鼠面部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有保護(hù)作用,當(dāng)神經(jīng)切斷后BDNF、NT-3逆行運(yùn)輸刊運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元急劇增加。外源性BDNF能延遲自然發(fā)生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的運(yùn)動(dòng)失能,減輕神經(jīng)肌肉萎縮和運(yùn)動(dòng)軸突消失。
基于軸索逆向運(yùn)輸原理,肌肉注射方式廣泛應(yīng)用于病毒介導(dǎo)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的轉(zhuǎn)染中。有研究證明在SOD1小鼠中肌肉注射AAV2-IGF1可延緩病程、延長(zhǎng)存活期,而肌肉注射的慢病毒介導(dǎo)VEGF的療效在同樣的動(dòng)物模型中也得到證明〔29〕。近年也有學(xué)者〔15〕發(fā)現(xiàn)椎管內(nèi)注射AAV2-IGF1可起到部分神經(jīng)保護(hù)作用,但尚未證明可延長(zhǎng)存活期。
相比效果甚微的利魯唑,這種方法需要起到多大效果方可應(yīng)用于臨床前實(shí)驗(yàn)仍還是個(gè)問(wèn)題〔30〕。因?yàn)锳LS患者迫切需要更有效的治療,所以治療的發(fā)展存在很大的市場(chǎng)機(jī)遇,盡管如此,大規(guī)模地將動(dòng)物模型從嚙齒類向大動(dòng)物轉(zhuǎn)變?nèi)猿蔀榧顾杌蛑委煹囊淮笳系K。目前MoNuDin仍為ALS患者基因治療臨床前試驗(yàn)階段的唯一方式。
5.3抗凋亡蛋白 凋亡是ALS發(fā)病機(jī)制的一個(gè)因素,所以在阻止神經(jīng)元細(xì)胞死亡的研究中抗凋亡亦倍受關(guān)注。已有研究證明在體外和SOD1小鼠轉(zhuǎn)染Bcl-xl和Bcl-2這類具抗凋亡作用的基因,對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用〔31〕。然而盡管這一結(jié)論在一些試驗(yàn)中得以證實(shí)但并不能代表其在基因治療中的進(jìn)展,仍待長(zhǎng)期的深入研究。
5.4基因沉默 基因沉默是指生物體中特定基因由于種種原因不表達(dá)或者是表達(dá)減少的現(xiàn)象。外源基因進(jìn)入細(xì)胞核后根據(jù)其作用機(jī)制和水平不同可分為三種:位置效應(yīng)、轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。
多數(shù)ALS 是由編碼SOD1基因顯性突變引起的,理論上可以通過(guò)基因沉默的方法治療。RNA 干擾(RNAi) 技術(shù)是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默方法,可以下調(diào)蛋白的表達(dá)。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中 RNAi 能發(fā)揮很好的作用。將穩(wěn)定的小干擾RNA(siRNA) 注入腦脊液中仍能敲除50% 的靶mRNA。表達(dá)了基因沉默siRNA的病毒載體已被用于治療ALS 動(dòng)物模型,但并未延長(zhǎng)生存期。
有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中突變基因的表達(dá)時(shí),可顯著降低發(fā)病后疾病進(jìn)展速度。雖然目前已有大量研究為成功選擇SOD1等位突變的基因沉默提供切實(shí)證據(jù),但在選擇性敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞或是肌細(xì)胞中的SOD1突變基因后,仍無(wú)法說(shuō)明ALS的發(fā)病機(jī)制或分辨不同細(xì)胞在病因?qū)W的作用。此外,病毒介導(dǎo)的SOD1基因沉默雖然可延長(zhǎng)SOD1小鼠的壽命〔32,33〕,但全身注射并不能證明可防止病情惡化〔34〕。近年來(lái)對(duì)新生小鼠肌肉注射AAV6、shRNAs、SOD1也未能阻止病情發(fā)展〔34〕。盡管如此,Isis制藥公司已對(duì)一種以反義寡核苷酸為基礎(chǔ)可抑制SOD1產(chǎn)生的藥物-ISIS-SOD1Rx(臨床試驗(yàn)標(biāo)識(shí)符NCT01041222),進(jìn)行第一階段的研究以評(píng)估安全性。
目前外源性基因治療無(wú)論從靶向、途徑和方法都未獲得滿意的療效,且具有嚴(yán)重的副作用和安全性風(fēng)險(xiǎn)。多數(shù)研究結(jié)果表明許多外源性基因治療是沒(méi)有可行性的。近來(lái)動(dòng)物研究〔35~38〕發(fā)現(xiàn)成年哺乳動(dòng)物腦和脊髓存在神經(jīng)前體細(xì)胞,在ALS等病理調(diào)節(jié)下,可以活化、增生和定向遷移到疾病受累解剖區(qū),發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)功能,但其修復(fù)能力有限,不能有效地改善神經(jīng)功能缺損。但這些研究結(jié)果為啟動(dòng)內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞的基因治療帶來(lái)了新的希望。如果能找到調(diào)控內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞活化、增生和定向遷移基因治療方法或途徑,必將為治療或延緩ALS帶來(lái)新的希望,也克服了外源性基因治療的許多缺陷。
綜上,基因治療是目前為止最有前景的靶向治療之一,它能從根本上治愈一些現(xiàn)有的常規(guī)療法所不能治愈的疾病,尤其是某些遺傳性疾病,同時(shí)其臨床應(yīng)用的倫理學(xué)和安全性仍存在爭(zhēng)議。對(duì)于ALS在現(xiàn)階段可行的基因治療方法僅僅局限于保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞或延緩其變性。
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