肌萎縮側(cè)索硬化的基因治療

陳章洲 徐仁伵

(吉安市泰和縣人民醫(yī)院內(nèi)科，江西 泰和 343700)

肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是一種進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病，由于上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性導(dǎo)致延髓、四肢、軀干等部位肌肉逐漸無(wú)力和萎縮，確診后3～5年患者多因呼吸肌麻痹而死亡，目前尚無(wú)有效的治療方法。利魯唑(riluzole)為谷氨酸拮抗劑，可使ALS患者的生存期平均延長(zhǎng)3 個(gè)月以上，是目前唯一被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)的臨床藥物。其他的治療措施還包括維生素、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及干細(xì)胞移植等，但都沒(méi)有確切效果?；蛑委煘橹委烝LS提供新的治療策略。

1 ALS發(fā)病機(jī)制

雖然ALS有特定的致病基因，但其發(fā)病仍與多種因素的互相影響有關(guān)。大約20%的家族遺傳性ALS(fALS)與銅/鋅超氧化物歧化酶-1(SOD1)基因突變有關(guān)，約5%與編碼TDP-43蛋白的TAR DNA結(jié)合蛋白(TARDBP)基因突變有關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)了更多與ALS患者相關(guān)的基因突變，如血管生成素(ANG)基因、囊泡相關(guān)膜蛋白相關(guān)蛋白B(VAPB)基因和脂肪肉瘤融合(FUS/TLS)基因〔1，2〕。不論散發(fā)性ALS(sALS)是否存在上述基因突變，但都有共同的病理特征，即運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性死亡、氧化應(yīng)激、神經(jīng)纖維異常、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙、軸突運(yùn)輸障礙、RNA結(jié)合蛋白的基因突變和炎癥因素都在ALS發(fā)病過(guò)程中起到作用。近年來(lái)，由于神經(jīng)遺傳學(xué)研究的進(jìn)展，ALS發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步闡明，導(dǎo)入外源性基因載體的改進(jìn)及其基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的進(jìn)步，使基因介導(dǎo)的治療正逐步實(shí)現(xiàn)。

2 基因治療的靶向選擇

2.1星形膠質(zhì)細(xì)胞 盡管在ALS中選擇性易損細(xì)胞為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞，但星形膠質(zhì)細(xì)胞可激發(fā)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡及炎癥反應(yīng)〔3～5〕，在疾病的發(fā)展過(guò)程中也起到調(diào)節(jié)作用。降低星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體水平可以導(dǎo)致ALS患者谷氨酸攝取障礙及繼發(fā)的興奮性毒性作用。興奮性氨基酸受體(EAAT2)主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，而EAAT2被抑制則是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞興奮性毒性的一個(gè)原因。在體外培養(yǎng)的研究中，大量表達(dá)EAAT2可以顯著增加谷氨酸的攝取率及提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)保護(hù)作用。SOD1小鼠的EAAT2增加可延緩其運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的丟失，若受體減少則在早期即表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的丟失〔6〕。由此可見(jiàn)增加膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸受體的表達(dá)有助于ALS的治療。盡管此結(jié)論在目前基因治療領(lǐng)域并未應(yīng)用，但通過(guò)在病灶區(qū)增加正常星形膠質(zhì)細(xì)胞以清除過(guò)量谷氨酸的細(xì)胞治療方式已被推薦〔7〕。

2.2神經(jīng)肌肉接頭 因?yàn)榻K板的失神經(jīng)支配為ALS的最初變化之一〔8〕，在早期即著眼于神經(jīng)肌肉接頭則成為保證運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元間聯(lián)系的重要方式〔9，10〕。對(duì)初生的SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠肌內(nèi)注射以腺病毒為載體整合的心肌營(yíng)養(yǎng)因子-1，可延緩神經(jīng)肌肉變性。同樣體外神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)的肌肉注射，在SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠疾病中期階段亦可增加神經(jīng)肌肉連接和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量〔11〕。近期有研究證明對(duì)初生轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行全身肌肉注射表達(dá)抗SOD1的腺病毒相關(guān)載體AAV6，可阻止肌肉萎縮但不能阻斷疾病的進(jìn)展〔12〕。

綜上所述，對(duì)于ALS要同時(shí)針對(duì)脊髓(如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞)和骨骼肌(如神經(jīng)肌肉接頭)進(jìn)行治療才有可能更全面得阻止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性。

3 動(dòng)物模型

目前以嚙齒類動(dòng)物為模型的研究已廣泛開(kāi)展，雖然已有可延長(zhǎng)動(dòng)物存活期及阻止神經(jīng)元丟失的報(bào)道，但治療與動(dòng)物模型的相關(guān)性仍存置疑，因?yàn)榻^大多數(shù)干預(yù)都在動(dòng)物發(fā)病以前進(jìn)行，而ALS患者卻已有明確臨床表現(xiàn)。除了現(xiàn)已熟悉的SOD轉(zhuǎn)基因小鼠，動(dòng)物模型也需要多元化。目前已有以豬作為SOD轉(zhuǎn)基因的大動(dòng)物模型，另也存在類似于ALS患者延髓麻痹的自發(fā)性喉部麻痹的犬類〔13〕及存在SOD1基因錯(cuò)義突變的脊髓變性犬類亦可作為ALS可能的大動(dòng)物模型，這些多元化的動(dòng)物模型有利于進(jìn)行ALS包括基因治療的在內(nèi)的各項(xiàng)研究。

4 給藥途徑

基因治療的途徑分為體外細(xì)胞介導(dǎo)法(ex vivo)和體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染法(in vivo)。ex vivo是指將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體自身或異體細(xì)胞(或異種細(xì)胞)，經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增后，輸回人體，此途徑比較經(jīng)典、安全，而且效果較易控制，但是步驟多、技術(shù)復(fù)雜、難度大，不容易推廣；in vivo 途徑是將外源基因裝配于特定的真核細(xì)胞表達(dá)載體，直接導(dǎo)入體內(nèi)。這種載體可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA。此途徑操作簡(jiǎn)便，容易推廣，但目前尚未成熟，存在療效持續(xù)時(shí)間短，免疫排斥及安全性等一系列問(wèn)題。

ALS基因治療的療效與以何種方式將轉(zhuǎn)基因物質(zhì)充分轉(zhuǎn)染運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞直接相關(guān)，而且其組織內(nèi)分布的彌散程度也決定了可能達(dá)到的最佳療效。事實(shí)上，在ALS基因治療的臨床實(shí)踐中，以何種途徑可以將安全有效的基因轉(zhuǎn)遞至脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，且呈彌散性分布，仍是一極大的挑戰(zhàn)。

近年來(lái)已有不少有關(guān)于ALS基因治療給藥途徑的研究。但在鼠類行之有效的非侵入性肌肉注射和神經(jīng)內(nèi)注射在大動(dòng)物模型中并未得到放大驗(yàn)證，這可能與轉(zhuǎn)運(yùn)載體無(wú)效和基因在脊髓的表達(dá)有限相關(guān)。目前已有研究證明對(duì)猴子行肌肉注射AAV6介導(dǎo)的基因后可得到大量的表達(dá)〔14〕，但對(duì)已累及遠(yuǎn)端軸索的患者是否可行仍待考究。另外可將基因更直接地轉(zhuǎn)移至脊髓的椎管內(nèi)注射，雖然在野生型SOD1動(dòng)物中已卓有成效〔15，16〕，但尚未得到臨床驗(yàn)證。有學(xué)者正在對(duì)ALS患者椎管內(nèi)注射進(jìn)行1期臨床研究，不過(guò)安全性問(wèn)題仍阻礙了其發(fā)展〔17〕。因肌肉、神經(jīng)、椎管內(nèi)注射途徑均不能將基因轉(zhuǎn)移至整個(gè)脊髓，僅僅可作為局限性基因傳遞方式。

當(dāng)前ALS基因治療的研究主要集中在以腺病毒為載體的AAV9，它可經(jīng)靜脈或鞘內(nèi)注射通過(guò)血腦屏障且對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有一定的選擇性〔18～20〕。另外還有一些學(xué)者〔18，21～23〕在大動(dòng)物模型中研究以這種載體及其彌漫性非侵入性注射后的基因表達(dá)情況。

5 外源基因及載體

5.1神經(jīng)保護(hù)作用 目前已證實(shí)對(duì)嚙齒類ALS動(dòng)物模型中瀕死運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)可延長(zhǎng)其存活期，這也是有關(guān)ALS治療研究的前提。但對(duì)于ALS患者進(jìn)行全身注射腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)或類胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1卻無(wú)獲益〔24，25〕?？赡芘c注射的不恰當(dāng)或不足量致其失活或縮短其半衰期有關(guān)。但以基因轉(zhuǎn)染方式給予神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子則是更有效的方法。

5.2病毒載體轉(zhuǎn)運(yùn)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、IGF-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等 AAV和慢病毒載體能作用于非分裂相細(xì)胞，而且能與宿主細(xì)胞基因組發(fā)生整合。以病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病的潛在治療方案，目前已有學(xué)者〔26～28〕在對(duì)帕金森病及阿爾茨海默病進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估此方式轉(zhuǎn)遞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的安全性及治療前景。動(dòng)物模型中分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可保護(hù)疾病狀態(tài)下的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞并延緩病程發(fā)展的大量論證是對(duì)ALS患者以基因方式轉(zhuǎn)染神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行治療的理論基礎(chǔ)。在sALS嚙齒類動(dòng)物模型中有大量成功的案例證明病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染GDNF、IGF-1和VEGF對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有保護(hù)作用。這些SOD1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的性狀與ALS患者的臨床表現(xiàn)類似。而用以轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)SOD1鼠起病時(shí)期及病程進(jìn)展的推遲程度，或多或少與其給藥途徑有關(guān)。

研究表明，發(fā)育及成熟運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元對(duì)BDNF、人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NT)-3、NT-4/5有反應(yīng)，BDNF、NT-3增加培養(yǎng)胎大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的活性,BDNF可防止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的自然死亡,并對(duì)損傷的新生大鼠面部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有保護(hù)作用,當(dāng)神經(jīng)切斷后BDNF、NT-3逆行運(yùn)輸刊運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元急劇增加。外源性BDNF能延遲自然發(fā)生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的運(yùn)動(dòng)失能，減輕神經(jīng)肌肉萎縮和運(yùn)動(dòng)軸突消失。

基于軸索逆向運(yùn)輸原理，肌肉注射方式廣泛應(yīng)用于病毒介導(dǎo)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的轉(zhuǎn)染中。有研究證明在SOD1小鼠中肌肉注射AAV2-IGF1可延緩病程、延長(zhǎng)存活期，而肌肉注射的慢病毒介導(dǎo)VEGF的療效在同樣的動(dòng)物模型中也得到證明〔29〕。近年也有學(xué)者〔15〕發(fā)現(xiàn)椎管內(nèi)注射AAV2-IGF1可起到部分神經(jīng)保護(hù)作用，但尚未證明可延長(zhǎng)存活期。

相比效果甚微的利魯唑，這種方法需要起到多大效果方可應(yīng)用于臨床前實(shí)驗(yàn)仍還是個(gè)問(wèn)題〔30〕。因?yàn)锳LS患者迫切需要更有效的治療，所以治療的發(fā)展存在很大的市場(chǎng)機(jī)遇，盡管如此，大規(guī)模地將動(dòng)物模型從嚙齒類向大動(dòng)物轉(zhuǎn)變?nèi)猿蔀榧顾杌蛑委煹囊淮笳系K。目前MoNuDin仍為ALS患者基因治療臨床前試驗(yàn)階段的唯一方式。

5.3抗凋亡蛋白 凋亡是ALS發(fā)病機(jī)制的一個(gè)因素，所以在阻止神經(jīng)元細(xì)胞死亡的研究中抗凋亡亦倍受關(guān)注。已有研究證明在體外和SOD1小鼠轉(zhuǎn)染Bcl-xl和Bcl-2這類具抗凋亡作用的基因，對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用〔31〕。然而盡管這一結(jié)論在一些試驗(yàn)中得以證實(shí)但并不能代表其在基因治療中的進(jìn)展，仍待長(zhǎng)期的深入研究。

5.4基因沉默 基因沉默是指生物體中特定基因由于種種原因不表達(dá)或者是表達(dá)減少的現(xiàn)象。外源基因進(jìn)入細(xì)胞核后根據(jù)其作用機(jī)制和水平不同可分為三種：位置效應(yīng)、轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。

多數(shù)ALS 是由編碼SOD1基因顯性突變引起的，理論上可以通過(guò)基因沉默的方法治療。RNA 干擾(RNAi) 技術(shù)是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默方法，可以下調(diào)蛋白的表達(dá)。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中 RNAi 能發(fā)揮很好的作用。將穩(wěn)定的小干擾RNA(siRNA) 注入腦脊液中仍能敲除50% 的靶mRNA。表達(dá)了基因沉默siRNA的病毒載體已被用于治療ALS 動(dòng)物模型，但并未延長(zhǎng)生存期。

有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中突變基因的表達(dá)時(shí)，可顯著降低發(fā)病后疾病進(jìn)展速度。雖然目前已有大量研究為成功選擇SOD1等位突變的基因沉默提供切實(shí)證據(jù)，但在選擇性敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞或是肌細(xì)胞中的SOD1突變基因后,仍無(wú)法說(shuō)明ALS的發(fā)病機(jī)制或分辨不同細(xì)胞在病因?qū)W的作用。此外，病毒介導(dǎo)的SOD1基因沉默雖然可延長(zhǎng)SOD1小鼠的壽命〔32，33〕，但全身注射并不能證明可防止病情惡化〔34〕。近年來(lái)對(duì)新生小鼠肌肉注射AAV6、shRNAs、SOD1也未能阻止病情發(fā)展〔34〕。盡管如此，Isis制藥公司已對(duì)一種以反義寡核苷酸為基礎(chǔ)可抑制SOD1產(chǎn)生的藥物-ISIS-SOD1Rx(臨床試驗(yàn)標(biāo)識(shí)符NCT01041222)，進(jìn)行第一階段的研究以評(píng)估安全性。

6 內(nèi)源性基因治療

目前外源性基因治療無(wú)論從靶向、途徑和方法都未獲得滿意的療效，且具有嚴(yán)重的副作用和安全性風(fēng)險(xiǎn)。多數(shù)研究結(jié)果表明許多外源性基因治療是沒(méi)有可行性的。近來(lái)動(dòng)物研究〔35～38〕發(fā)現(xiàn)成年哺乳動(dòng)物腦和脊髓存在神經(jīng)前體細(xì)胞，在ALS等病理調(diào)節(jié)下，可以活化、增生和定向遷移到疾病受累解剖區(qū)，發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)功能，但其修復(fù)能力有限，不能有效地改善神經(jīng)功能缺損。但這些研究結(jié)果為啟動(dòng)內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞的基因治療帶來(lái)了新的希望。如果能找到調(diào)控內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞活化、增生和定向遷移基因治療方法或途徑，必將為治療或延緩ALS帶來(lái)新的希望，也克服了外源性基因治療的許多缺陷。

綜上，基因治療是目前為止最有前景的靶向治療之一，它能從根本上治愈一些現(xiàn)有的常規(guī)療法所不能治愈的疾病，尤其是某些遺傳性疾病，同時(shí)其臨床應(yīng)用的倫理學(xué)和安全性仍存在爭(zhēng)議。對(duì)于ALS在現(xiàn)階段可行的基因治療方法僅僅局限于保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞或延緩其變性。

7 參考文獻(xiàn)

1Millecamps S，Salachas F，Cazeneuve C,etal.SOD1，ANG，VAPB，TARDBP，and FUS mutations in familial amyotrophic lateral sclerosis:genotype -phenotype correlations〔J〕.J Med Genet，2010;47:554- 60.

2Traub R,Mitsumoto H，Rowland LP.Research advances in amyotrophic lateral sclerosis，2009 to 2010〔J〕.Curr Neurol Neurosci Rep， 2011;11:67-77.

3Barbeito LH，Pehar M，Cassina P,etal.A role for astrocytes in motor neuron loss in amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Brain Res Brain Res Rev，2004；47:263 -74.

4Nagai M，Re DB，Nagata T,etal.Astrocytes expressing ALS-linked mutated SOD1 release factors selectively toxic to motor neurons〔J〕.Nat Neurosci，2007；10:615 -22.

5Yamanaka K,Chun SJ，Boillee S,etal.Astrocytes as determinants of disease progression in inherited amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Nat Neurosci， 2008；11:251-3.

6Pardo AC,Wong V,Benson LM,etal.Loss of the astrocyte glutamate transporter GLT1 modifies disease in SOD1 (G93A) mice〔J〕.Exp Neurol，2006;201:120- 30.

7Lepore AC，Rauck B,Dejea C,etal.Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease〔J〕. Nat Neurosci， 2008；11:1294- 301.

8Fischer L,Culver D,Tennant P,etal.Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy:evidence in mice and man〔J〕.Exp Neurol， 2004；185:232-40.

9Dupuis L,Echaniz-Laguna A.Skeletal muscle in motor neuron diseases:therapeutic target and delivery route for potential treatments〔J〕.Curr Drug Targets，2010；11:1250-61.

10Dupuis L，Loef fler JP.Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis:insights from transgenic models〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2009;9:341-6.

11Suzuki M，McHugh J,Tork C,etal.Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS〔J〕.Mol Ther，2008；16:2002-10.

12Towne C，Setola V,Schneider BL,etal.Neuroprotection by gene therapy targeting mutant SOD1 in individual pools of motor neurons does not translate into therapeutic benefit in fALS mice〔J〕.Mol Ther，2011；19:274-83.

13Stanley BJ，Hauptman JG，F(xiàn)ritz MC,etal.Esophageal dysfunction in dogs with idiopathic laryngeal paralysis:a controlled cohort study〔J〕. Vet Surg，2010;39:139-49.

14Towne C,Schneide r BL,Kieran D,etal.Efficient transduction of non-human primate motor neurons after intramuscular delivery of recombinant AAV serotype 6〔J〕.Gene Ther，2009;17(1):141-6.

15Franz CK,Federici T,Yang J,etal.Intraspinal cord delivery of IGF-I mediated by adeno-associated virus 2 is neuroprotective in a rat model of familial ALS〔J〕.Neurobiol Dis，2009；33:473-81.

16Lepore AC,HaenggeliC,Gasmi M,etal.Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS 〔J〕.Brain Res，2007;1185:256-65.

17Lunn JS，Sakowski SA,Federici T,etal.Stem cell technology for the study and treatment of motor neuron diseases〔J〕.Regen Med，2011;6:201-13.

18Duque S,Joussemet B，Riviere C,etal.Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons〔J〕.Mol Ther，2009;17:1187-96.

19Foust KD，Nurre E,Montgomery CL,etal.Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes〔J〕.Nat Biotechnol，2009；27:59- 65.

20Snyder BR，Gray SJ,Quach ET,etal.Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery〔J〕. Hum Gene Ther，2011;22(9):1129-35.

21Federici T，Taub JS，Baum GR,etal.Robust motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9.GFP to pigs〔J〕.Gene Ther ，2011；15:10.1038.2011：130.

22Foust KD，Bevan AK，Braun L,etal.Biodistribution of IV injected AAV9 in young cynomologus macaques.ASGCT 14th Annual Meeting〔M〕.Seattle：Nature Publishing Group，2011：152.

23Gray SJ，Matagne V，Bachaboina L,etal.Preclin-ical differences of intravascular AAV9 deli very to neurons and glia:a comparative study of adult mice and nonhuman primates〔J〕.Mol Ther，2011;19(6):1058-69.

24Federici T，Boulis N.Gene-based treatment of motor neuron diseases〔J〕. Muscle Nerve，2006；33:302-23.

25Sorenson EJ，Windbank AJ，Mandrekar JN,etal.Subcutaneous IGF-1 is not beneficial in 2-year ALS trial〔J〕.Neurology， 2008;71:1770-5.

26Marks Jr，WJ，Ostrem JL，Verhagen L,etal.Safety and tolerability of intraputaminal delivery of CERE-120 (adeno-associated virus serotype 2-neurturin) to patients with idiopathic Parkinson′s disease:an open-label，phase I trial〔J〕.Lancet Neurol， 2008；7:400-8.

27Snyder BR，Boulis NM，F(xiàn)ederici T.Viral vector-mediated gene transfer for CNS disease〔J〕.Expert Opin Biol Ther， 2010;10:381- 94.

28Tuszynski MH，Thal L，Pay M,etal.A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease〔J〕.Nat Med，2005；11:551 -5.

29Azzouz M，Ralph GS，Storkebaum E,etal.VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model〔J〕.Nature，2004;429:413-7.

30Scott S，Kranz JE,Cole J,etal.Design， power，and interpretation of studies in the standard murine model of ALS〔J〕.Amyotroph Lateral Scler，2008;9:4-15.

31Garrity-Moses ME,Teng Q，Liu J,etal.Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-(x)L gene transfer in models of motor neuron disease〔J〕. Muscle Nerve，2005;32:734 -44.

32Ralph GS,Radcliffe PA，Day DM,etal.Silencing mutant S OD1 using RNAi protects against neurodegeneration and extends survival in a n ALS model〔J〕.Nat Med ，2005;11:429-33.

33Raoul C,Abbas-Terki T,Bensadoun JC,etal.Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS〔J〕.Nat Med，2005;11:423-8.

34Towne C,Raoul C,Schneider BL,etal.Systemic AAV6 delivery mediating RNA interferenc e against SOD1:neuromuscular transduction does not alter disease progression in fALS mice〔J〕.Mol Ther，2008;16:1018-25.

35Xu R，Wu C，Tao Y,etal.Description of distributed features of the nestin-containing cells in brains of adult mice:a potential source of neural precursor cells〔J〕.J Neurosci Res，2010;88(5):945-56.

36Xu R,Wu C,Tao Y,etal.Nestin-positive cells in the spinal cord:a potential source of neural stem cells〔J〕.Int J Dev Neurosci，2008;26(7):813-20.

37Chi L,Gan L,Luo C,etal.Temporal response of neural progenitor cells to disease onset and progression in amyotrophic lateral sclerosis-like transgenic mice〔J〕.Stem Cells Dev，2007;16(4):579-88.

38Chi L,Ke Y,Luo C,etal.Motor neuron degeneration promotes neural progenitor cell proliferation，migration，and neurogenesis in the spinal cords of amyotrophic lateral sclerosis mice〔J〕.Stem Cells，2006;24(1):34-43.