生鱉甲與醋鱉甲抗肝纖維化有效部位的HPCE指紋圖譜分析

陳 凱

江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029

鱉甲為鱉科動(dòng)物鱉的背甲，具有軟堅(jiān)散結(jié)、滋陰潛陽(yáng)以及除蒸退熱功效，常用于治療肝纖維化，入藥一般為醋制鱉甲[1]。中醫(yī)認(rèn)為，生鱉甲具有非常強(qiáng)的潛陽(yáng)熄風(fēng)與養(yǎng)陰清熱功效，主要用于虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)、內(nèi)傷虛熱或者熱病傷陰等病癥。

1 實(shí)驗(yàn)材料

5000型BeckmanP/AsystemHPCE儀;FD-1A-50冷凍干燥機(jī);78-1型磁力加熱攪拌器;KQ-250B超聲波清洗器。水為雙蒸水，鱉甲藥材來(lái)自浙江衢化醫(yī)院，其中所選10批醋鱉甲是根據(jù)《中華藥典》由10批生鱉甲炮制而成。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 稱取25g生鱉甲粉，加水200ml進(jìn)行20min的超聲提取，抽濾，所留殘?jiān)?0ml水，超聲10min，合并濾液，抽濾，冷凍，取凍干粉，加入少量水進(jìn)行溶解，并放在透析膜中，200ml的純水膜外溶液，2次透析，5h/次，合并膜外溶液，同時(shí)冷凍干燥。對(duì)5.0mg/ml凍干粉水溶液進(jìn)行精密稱取，在通過(guò)0.22μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，根據(jù)鱉甲供試品相同炮制方法，對(duì)醋鱉甲供試品溶液進(jìn)行炮制。

2.2 有效組分對(duì)照組與對(duì)照品溶液的制備 從本實(shí)驗(yàn)中鱉甲有效抗肝纖維化物質(zhì)中所分離出的活性五肽，進(jìn)行0.1mg/ml濃度水溶液的配制，并將其視為對(duì)照品溶液;同時(shí)把實(shí)驗(yàn)中藥理篩選與經(jīng)柱色譜分離出的活性組酚酞，進(jìn)行0.1mg/ml濃度水溶液的配制，并將其視為有效組分對(duì)照組溶液，對(duì)兩溶液進(jìn)行分析對(duì)比。

2.3 色譜條件 57cm×75μm的熔融未涂層石英毛細(xì)管，49cm的有效長(zhǎng)度，100mmol/L優(yōu)級(jí)純?nèi)杓谆被淄?20mmol/L磷酸氫二鈉的運(yùn)行緩沖液，18KV的分離電壓，254nm的檢測(cè)波長(zhǎng)，20℃的柱溫[2]。

2.4 指紋圖譜的測(cè)定

2.4.1 生鱉甲有效物質(zhì)部位HPCE指紋圖譜 通過(guò)毛細(xì)管區(qū)電泳法對(duì)供試品溶液進(jìn)行制備，并根據(jù)以上色譜條件對(duì)生物鱉有效物質(zhì)部位HPCE進(jìn)行測(cè)定，對(duì)電泳圖進(jìn)行30min的記錄。對(duì)17個(gè)共有峰進(jìn)行標(biāo)定，指紋圖譜中峰面積較大與較穩(wěn)定的14號(hào)峰屬于參照峰s，對(duì)各共有峰保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，17個(gè)生鱉甲指紋圖譜共有峰，存在0.94以上的HPCE圖譜相似度。

2.4.2 醋鱉甲有效物質(zhì)部位HPCE指紋圖譜 采用相同方法對(duì)供試品溶液進(jìn)行制備，并根據(jù)以上色譜條件對(duì)生物鱉有效物質(zhì)部位HPCE進(jìn)行測(cè)定，對(duì)電泳圖進(jìn)行30min的記錄。對(duì)19個(gè)共有峰進(jìn)行標(biāo)定，指紋圖譜中峰面積較大與較穩(wěn)定的15號(hào)峰屬于參照峰s，對(duì)各共有峰保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19個(gè)生鱉甲指紋圖譜共有峰，存在0.93以上的HPCE圖譜相似度。

對(duì)照10批醋鱉甲與生鱉甲指紋圖譜，兩批相似度下降，為0.86-0.93。此外，對(duì)照10批生鱉甲與醋鱉甲指紋圖譜，兩批相似度也下降，為0.86-0.92。由此表明，鱉甲醋制前后，其含量與化學(xué)成分存在很大差異性。

3 討論

實(shí)驗(yàn)對(duì)炮制鱉甲前后的HPCE指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比與分析發(fā)現(xiàn)，生鱉甲與醋鱉甲抗肝纖維化有效物質(zhì)部位HPCE指紋圖譜峰面積與指紋峰數(shù)量都有非常大的差異性，而且醋鱉甲指紋峰要比生鱉甲多，由此表明，醋鱉甲中含有新活性五肽HGRFG指紋峰，從而闡釋了醋鱉甲抗桿纖維化要比生鱉甲效果好，同時(shí)也為醋鱉甲治療肝纖維化提供有效科學(xué)依據(jù)，為鱉甲醋法炮制機(jī)理進(jìn)行深入探討奠定良好基礎(chǔ)。

[1]高建蓉，張赤志，邵志華，等.鱉甲對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖影響的研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2007，23(11):1618-1620.

[2]陳進(jìn)文，高建蓉，王光忠，等.鱉甲抗肝纖維化有效物質(zhì)部位高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究[J].中藥材，2009，32(6):848-851.