內(nèi)阿米巴屬原蟲分子檢測及基因分型方法研究進(jìn)展

董海聚，王榮軍，張龍現(xiàn)

阿米巴原蟲屬于肉足鞭毛門、肉足亞門、跟足總綱、葉足綱、阿米巴目的成員，根據(jù)其生活環(huán)境不同分為內(nèi)阿米巴和自由生活阿米巴，前者寄生于人和動物，主要有4個屬，即內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba)、內(nèi)蜒屬(Endolimax)、嗜碘阿米巴屬(Iodamoeba)和脆雙核阿米巴屬(Dientamoeba)；后者生活在水和泥土中，偶爾侵入動物機(jī)體，主要有5個屬，即耐格里屬(Naegleria)、棘阿米巴屬(Acanthamoeba)、哈曼屬(Hartmannella)、Vablkampfia屬和Sappinia屬。其中內(nèi)阿米巴屬原蟲可引起人和動物出現(xiàn)痢疾和肝膿腫等癥狀，危害較為嚴(yán)重，據(jù)報道溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(Entamoebahistolytica，E.histolytica)每年可引起5 000萬人發(fā)生阿米巴痢疾和肝膿腫，可導(dǎo)致10萬人死亡[1]，因此，引起了國內(nèi)外研究者的高度關(guān)注。20世紀(jì)早期，內(nèi)阿米巴屬原蟲的命名大多是根據(jù)其感染的宿主以及其包囊或滋養(yǎng)體形態(tài)的差異而定，目前已知命名的種類有E.histolytica、E.dispar、E.moshkovskii、E.coli、E.polecki、E.hartmanni、E.bovis、E.ovis、E.dilimani和E.suis等，其中，感染人的主要包括E.histolytica、E.dispar、E.moshkovskii、E.coli、E.polecki和E.hartmanni，且主要寄生于人的小腸，目前認(rèn)為E.histolytica是唯一有根據(jù)被確定為致病性的內(nèi)阿米巴原蟲，而且被認(rèn)為是引起人死亡的主要寄生蟲之一[2-3]，E.polecki一般不致病，但也有少數(shù)人出現(xiàn)腹瀉癥狀的報道。不同種類的內(nèi)阿米巴原蟲包囊和滋養(yǎng)體的形態(tài)極為相似，E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii的滋養(yǎng)體直徑約10～50 μm，包含1個單核，包囊直徑約10～15 μm，包含1～4個核，未成熟包囊有1～2個核，成熟包囊具有4個核，從形態(tài)上難以區(qū)分；E.hartmanni包囊直徑小于10 μm，從形態(tài)上能與E.histolytica/E.dispar/E.moshkovskii進(jìn)行鑒別，但有時一些E.hartmanni包囊直徑會大于10 μm，如嚴(yán)格根據(jù)形態(tài)進(jìn)行區(qū)分，可能會誤認(rèn)為E.histolytica/E.dispar/E.moshkovskii；E.coli包囊直徑10～30 μm，而且核的形態(tài)與E.histolytica/E.dispar/E.moshkovskii有所不同，前者的內(nèi)含體常偏離中央，后者位于中央，前者的核膜染色質(zhì)內(nèi)襯更加粗糙，上面的顆粒更大；E.polecki包囊為單核，僅有1%的包囊處于2個核的發(fā)育階段。

理論上來講，能夠根據(jù)包囊或滋養(yǎng)體的形態(tài)將一些內(nèi)阿米巴原蟲區(qū)分，但在實際操作過程中很難區(qū)分，尤其是E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii，再加上檢測方法等方面的因素，以前的報道盲目擴(kuò)大了E.histolytica的感染率，因此，目前主要通過分子診斷方法對其進(jìn)行種類的鑒定和基因分型。

1 常規(guī)檢測方法

在分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的早期，研究者主要使用酶譜型和抗原檢測來確定內(nèi)阿米巴原蟲的感染情況。

1.1酶譜型 酶譜型技術(shù)是最早應(yīng)用于區(qū)分內(nèi)阿米巴原蟲分離株的方法，并且長期作為區(qū)分其分離株的金標(biāo)準(zhǔn)，該法的缺點是必須使用培養(yǎng)的滋養(yǎng)體、耗時和敏感性極低，因此，目前很少被采用，但該法在早期對E.histolytica和E.dispar的區(qū)分起到了重要的作用[4]。

1.2抗原檢測 目前用于抗原檢測的腸道內(nèi)阿米巴原蟲主要是E.histolytica，其特異性檢測主要使用商品化的檢測試劑盒，但選用的單抗主要是針對同一抗原決定簇：E.histolytica的Gal/GalNac特異性植物凝集素。孟加拉國E.histolytica高度傳播區(qū)的一些研究顯示抗原檢測的敏感性與PCR檢測結(jié)果相似[5]，非高度傳播區(qū)研究顯示其敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PCR檢測結(jié)果，到目前為止，在E.histolytica高發(fā)區(qū)適合抗原檢測，但在非高發(fā)區(qū)效果不佳[6]。

2 分子檢測方法

最早用于區(qū)分E.histolytica和E.dispar的方法包括兩種普通PCR，主要基于核糖體小亞基RNA(SSU rRNA)[7]和編碼過氧化物酶(30-kDa 蛋白)的基因[8]，且這些技術(shù)已廣泛應(yīng)用于世界各地。目前，用于鑒定和區(qū)分E.histolytica和E.dispar的一些更新的方法正在應(yīng)用，主要包括雙重、多重、巢式和實時定量PCR等，另外，還發(fā)展了大量用于檢測E.moskhovskii的方法[9-10]。

2.1普通PCR 在發(fā)達(dá)國家，PCR方法多用于臨床和流行病學(xué)研究，而且已經(jīng)被WHO高度認(rèn)可。采用PCR方法已經(jīng)在不同的臨床樣品(如糞便、組織和肝膿腫穿刺物)中檢測到了腸道內(nèi)阿米巴原蟲。據(jù)報道，基于SSU rRNA的PCR檢測敏感性大約是最好的ELISA試劑盒檢測的100倍[11]。Edman等[12]用PCR擴(kuò)增編碼125 kDa的表面抗原，這種方法后來配合限制性片段多態(tài)性分析用于區(qū)分不同種類的內(nèi)阿米巴原蟲[13]，但這些研究所用的DNA均從實驗室保存的陽性樣品中提取。

目前有許多針對不同基因的PCR方法用于檢測和區(qū)分E.histolytica/E.dispar/E.moshkovskii，如SSU rRNA、HLY6基因、編碼30-kDa蛋白基因等。由于在E.histolytica和E.dispar的SSU rRNA之間存在著穩(wěn)定的遺傳偏差，因此，SSU rRNA已成區(qū)分蟲種的一個重要靶基因[7]。通過從培養(yǎng)的滋養(yǎng)體和鏡檢陽性樣品中直接提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增證明SSU rRNA可用于檢測內(nèi)阿米巴原蟲，具有很好的敏感性和特異性。由于SSU rRNA具有多拷貝性，且存在于內(nèi)阿米巴原蟲染色體外質(zhì)粒中[14]，使其比單拷貝基因的DNA片段更易檢測，目前已廣泛應(yīng)用于內(nèi)阿米巴原蟲的檢測和區(qū)分。

有人根據(jù)29-kDa/30-kDa抗原基因設(shè)計引物，利用傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增來區(qū)分致病性和非致病性內(nèi)阿米巴原蟲[8]，該目的基因可用于分析實驗室內(nèi)培養(yǎng)的經(jīng)顯微鏡檢查確認(rèn)的陽性糞便樣品，也可用于實驗室培養(yǎng)物和被福爾馬林固定的糞便樣品的檢測[15]。

用于PCR擴(kuò)增的其他目的基因包括兩個蛋白質(zhì)編碼基因，這兩個基因在其編碼區(qū)具有多態(tài)性，即富含絲氨酸的E.histolytica蛋白基因(SREPH)[16]和甲殼素基因[17]，有人利用鏡檢陽性糞便DNA進(jìn)行基于SREPH基因的巢式PCR擴(kuò)增曾感染一人群的E.histolytica的差異[18]，SREPH作為目的基因也已用于實驗室培養(yǎng)物和通過硫酸鋅梯度漂浮濃集后的鏡檢陽性糞便DNA的PCR擴(kuò)增[19]。

應(yīng)用半胱氨酸蛋白酶基因和肌動蛋白基因作為目的基因的PCR也曾用于阿米巴病的流行病學(xué)研究[20]。另外，基于E.histolytica溶血素基因HLY6的PCR檢測也已發(fā)展用于糞便和肝膿腫樣品中E.histolyticaDNA 的檢測，而且敏感性和特異性均為100% (hemo-PCR)[21]。

為提高PCR檢測的敏感性，有人用巢式多普勒PCR對糞便鏡檢陽性樣品中的DNA進(jìn)行檢測并區(qū)分E.histolytica和E.dispar，利用這種多普勒技術(shù)，其敏感性和特異性分別為94%和100%[22]，此法也已成功應(yīng)用于檢測福爾馬林固定樣品中的E.histolytica和E.dispar。利用與生物素探針結(jié)合的特異性引物擴(kuò)增E.histolytica和E.dispar的染色體外環(huán)狀DNA，PCR-ELISA結(jié)果表明在臨床樣品中檢測和區(qū)分這兩種內(nèi)阿米巴原蟲敏感性較高[23]。

也有研究者利用PCR技術(shù)對肝膿腫樣品中的內(nèi)阿米巴原蟲進(jìn)行檢測，首次用編碼30-kDa抗原基因?qū)Ω文撃[樣品中提取的DNA進(jìn)行E.histolytica的PCR檢測，敏感度為100%。也有人用同樣的引物，發(fā)現(xiàn)敏感度僅33%，而使用另一對針對30-kDa抗原基因的特異性引物，敏感度可達(dá)100%。為驗證使用不同引物進(jìn)行的PCR檢測結(jié)果，有人用10種以前發(fā)表的不同的引物(用來擴(kuò)增肝臟和糞便中的E.histolyticaDNA)直接擴(kuò)增檢測肝膿腫膿汁中的E.histolyticaDNA[24]，在這10種引物中，針對E.histolytica的染色體外環(huán)狀DNA的引物p1-p2和針對30-kDa抗原基因的引物p11-p12敏感性為100%；基于溶血素基因HLY6的hemo-PCR用于檢測肝膿腫樣品，其陽性率達(dá)89%，30-kDa抗原基因和18SrDNA的PCR擴(kuò)增，陽性率分別為77%和28%[21]，因此，Hemo-PCR成為檢測肝膿腫和糞便樣品中E.histolytica的一種非常有價值的診斷工具。

對于糞便中的E.moshkovskii的檢測，Haque等首次報道了指紋分析的方法[5]，隨后，發(fā)展了基于SSU rRNA的巢式PCR擴(kuò)增后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化的方法對其進(jìn)行鑒定[9]，通過這種方法對采用QIAGEN糞便提取試劑盒直接從糞便中提取的DNA進(jìn)行檢測，敏感性和特異性均達(dá)100%[25]。

盡管應(yīng)用PCR技術(shù)檢測這些內(nèi)阿米巴原蟲已經(jīng)非常成功，但在常規(guī)診斷中推廣應(yīng)用卻非常有限，其中的重要原因是糞便中DNA的提取困難，而且，DNA的擴(kuò)增和檢測耗時，費錢，另外，環(huán)境和臨床樣品中產(chǎn)生的非特異性DNA片段經(jīng)常會導(dǎo)致假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。

2.2實時定量PCR 實時定量PCR具有可消除PCR擴(kuò)增后的分析、縮短循環(huán)次數(shù)、減少實驗室擴(kuò)增產(chǎn)物的污染和降低試劑成本等優(yōu)點，很適合實驗室診斷。研究者已開始用不同的實時定量PCR對E.histolytica和E.dispar進(jìn)行鑒別診斷，包括應(yīng)用雜交探針檢測SSU rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的Light cycler法和兩種Taqman法，其中一種是針對SSU rRNA，另一種針對游離基因重復(fù)片段的檢測，所檢測樣品均為非人靈長類和人糞便樣品中提取的DNA[26]。已有報道用針對SSU rRNA片段的信標(biāo)實時定量PCR檢測糞便和肝膿腫樣品中的E.histolytica[27]。Qvarnstrom等報道了基于18S rRNA的熒光染料定量PCR檢測方法[28]，在這些定量PCR研究中大多數(shù)選擇的靶序列都是rRNA，通過對3種定量PCR方法進(jìn)行了評價，強調(diào)了每種方法的優(yōu)缺點，以及在臨床診斷中的應(yīng)用，該研究還強調(diào)了不同檢測方法的局限性和檢測性能的主要區(qū)別，但該研究中的Light Cycler和針對游離基因的Taqman檢測法不能用于區(qū)分E.histolytica和E.dispar[26]。隨后出現(xiàn)了針對不同腸道寄生蟲檢測的敏感性和特異性均為100%的多重定量PCR，這種方法可檢測E.histolytica、G.lamblia和C.parvum，而且還可推廣至腸道寄生蟲感染的常規(guī)診斷方法[29]。確切的診斷結(jié)果要求檢測樣品的處理和反應(yīng)條件必須標(biāo)準(zhǔn)化，具有國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的多普勒或多重PCR方法解決了這個問題。目前針對臨床樣品進(jìn)行E.moshkovskii檢測的定量PCR尚未見報道，需要進(jìn)一步研究。

盡管定量PCR能敏感到檢測單個細(xì)胞，但一個反應(yīng)中可應(yīng)用的探針數(shù)量有限，因此影響了多目的基因的檢測和基因分析[28]。當(dāng)使用同一引物進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增時，如一種樣品的量過大可能會影響第二種樣品的檢測，僅通過使用不同探針來區(qū)分目的基因的多普勒或多重定量PCR不適合在一個反應(yīng)中同時檢測多種微生物，另外，定量PCR與糞便樣品的顯微鏡檢查和抗原檢測相比，費用較高，因此，在E.histolytica流行的貧困地區(qū)，很少應(yīng)用定量PCR進(jìn)行檢測，目前在發(fā)達(dá)國家的臨床實驗室中，定量PCR主要用來診斷高危人群的阿米巴痢疾，高危人群包括同性戀、旅游者和來自E.histolytica流行地區(qū)的入境者等。

2.3基因芯片技術(shù) DNA芯片是用于病原檢測的新技術(shù)，其結(jié)果快速、敏感，包括以下4個步驟：DNA提取、目的基因擴(kuò)增、標(biāo)記的DNA與固定在芯片上的寡核苷酸探針雜交和數(shù)據(jù)分析。近年來，寡核苷酸芯片已經(jīng)成功應(yīng)用于許多病原的診斷，它在臨床和流行病學(xué)調(diào)查研究中對寄生蟲的檢測和鑒定具有重要作用。Wang等最早報道的寡核苷酸芯片是在同一反應(yīng)中同時檢測E.histolytica、E.dispar、G.lamblia集聚體A、B和C.parvum1型和2型，具有很高的特異性和敏感性[30]。除了區(qū)分主要基因型之外，這種方法在鑒定和區(qū)分E.moshkovskii和E.histolytica方面非常有效，但是，該研究選用的材料是從不同寄生蟲的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)株中提取純化的DNA[30]，因此，其實際應(yīng)用價值尚需進(jìn)一步研究。近來發(fā)展了一種采用E.histolytica(HM-1：IMSS)的DNA克隆進(jìn)行的基于芯片的基因分型技術(shù)(比較基因組雜交技術(shù))，這是首次對內(nèi)阿米巴分離株的全基因組分析，結(jié)果顯示，此技術(shù)能夠區(qū)分E.histolytica和E.dispar、能鑒定有毒力蟲株的保守基因，還能發(fā)現(xiàn)潛在的基因型-表型關(guān)系[31]。

芯片技術(shù)目前主要作為一種研究工具，很少應(yīng)用于寄生蟲檢測和鑒別的臨床診斷實驗室。然而，隨著芯片技術(shù)檢測費用的降低，此技術(shù)可能排在寄生蟲研究技術(shù)的前列。

3 基因分型方法

臨床研究發(fā)現(xiàn)不同E.histolytica蟲株的致病力存在一定差異，因此有必要對這些蟲株進(jìn)行分型鑒定，確定其是否存在差異，然而，到目前為止，蟲株鑒定工具十分有限。同工酶分析提供了第一種標(biāo)記，但現(xiàn)在已知的同工酶譜不固定，因此，很多已命名的酶譜已不可靠。對于內(nèi)阿米巴原蟲，目前主要是針對SREHP基因、株特異性基因(SSG)、連接tRNA基因的短串聯(lián)重復(fù)和甲殼素基因等進(jìn)行基因分型。

Clark和Diamond描述了E.histolytica的種內(nèi)變異，根據(jù)來自世界不同地區(qū)的E.histolytica培養(yǎng)物的研究表明SREHP基因和株特異性基因(SSG)具有明顯的多態(tài)性。編碼免疫顯性表面抗原的SREHP基因編碼包括8和12氨基酸串聯(lián)重復(fù)，通過糞便和肝臟樣品中提取的DNA進(jìn)行基于SREHP基因的巢式PCR研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引起腸炎或肝臟疾病的E.histolytica株內(nèi)存在明顯的差異[18]，但這些發(fā)現(xiàn)后來遭到了Haghighi等反駁[32]。SSG作為非編碼基因，包含了大小從8～16 bp的串聯(lián)重復(fù)序列，根據(jù)E.histolytica株內(nèi)的重復(fù)數(shù)量可用來鑒別蟲株，由于某些蟲株完全缺失該位點，所以，很難作為種內(nèi)分型標(biāo)記[33]。

使用連接tRNA基因的短串聯(lián)重復(fù)對E.histolytica進(jìn)行基因分型可有利于對基因型與感染結(jié)果之間的可能關(guān)系進(jìn)行調(diào)查[34]。甲殼素基因[35]是編碼一個退化的7-氨基酸序列串聯(lián)重復(fù)的基因，將其作為一種標(biāo)記物已經(jīng)對不同地域的糞便樣品中提取的DNA進(jìn)行了進(jìn)行E.dispar種群的研究，發(fā)現(xiàn)有不同蟲株的存在[19]。

其他針對重復(fù)序列的分型方法包括用于檢測種間和種內(nèi)差異的微衛(wèi)星分型法，微衛(wèi)星是包含有像(CT)n這樣簡單基序的DNA片段，微衛(wèi)星分型是利用特異性引物通過PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星進(jìn)行的。包含內(nèi)部重復(fù)序列的兩個微衛(wèi)星位點，位點1-2和5-6，對于E.histolytica和E.dispar顯示出了可變的多態(tài)性[36-37]，提示這兩個位點可作為E.histolytica和E.dispar流行病學(xué)調(diào)查分子標(biāo)記的潛在可能性。

指紋分析在E.moshkovskii分離株中顯示出了相當(dāng)大的遺傳差異，有人應(yīng)用EmR引物對E.moshkovskii樣品進(jìn)行多態(tài)性檢測，該研究由于在引物結(jié)合部位顯示出了序列的不同而獲得了一些成功[9]。隨著人糞便中檢測到E.moshkovskii數(shù)量的日益增多，關(guān)于E.moshkovskii分型方面的進(jìn)一步研究將有利于此種阿米巴原蟲感染的流行病學(xué)調(diào)查研究。

4 小 結(jié)

由E.histolytica引起的阿米巴病是人和動物感染的最常見的寄生蟲病之一，在過去20多年中，有關(guān)該寄生蟲不同方面的研究為當(dāng)前及今后的研究方向奠定了良好的基礎(chǔ)，比如與其關(guān)系較密切的E.dispar和E.moshkovskii等之間的鑒別診斷、E.histolytica的重新定義、E.dispar的重新描述以及來自病人的E.moshkovkii的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)很大程度上改變了群落內(nèi)不同內(nèi)阿米巴種類的流行情況。根據(jù)上述診斷方法和基因分型方法的優(yōu)缺點及其使用局限性和可行性，為準(zhǔn)確鑒定和區(qū)分臨床檢驗中的三種內(nèi)阿米巴原蟲，開發(fā)新的方便、易行、快捷、費用低、敏感性高的檢測方法已迫在眉睫，這對于疾病的診斷及其患者的臨床用藥等方面均可起到積極的指導(dǎo)作用，另外，探索出更穩(wěn)定可靠的基因分型方法，對于內(nèi)阿米巴原蟲的分子流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制和傳播機(jī)制等方面的研究將起著至關(guān)重要的作用。

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