重組人睫神經(jīng)營養(yǎng)因子（rhCNTF）對營養(yǎng)性肥胖大鼠減肥作用的實驗研究

張書文

（遼寧省阜新市衛(wèi)生學校，遼寧 阜新 123000）

重組人睫神經(jīng)營養(yǎng)因子（rhCNTF）對營養(yǎng)性肥胖大鼠減肥作用的實驗研究

張書文

（遼寧省阜新市衛(wèi)生學校，遼寧 阜新 123000）

胖在21世紀已作為一種疾病被人們普遍關(guān)注，從而使減肥藥物的研究受到了前所未有的重視。重組人睫神經(jīng)營養(yǎng)因子（recombinant human ciliary neurotrophic factor，rhCNTF）是第一個運用生物工程技術(shù)研發(fā)的蛋白多肽類減肥藥物。

睫神經(jīng)營養(yǎng)因子；減肥作用；Lee's指數(shù)；脂肪系數(shù)；絨毛密度

肥胖在21世紀已作為一種疾病被人們普遍關(guān)注，從而使減肥藥物的研究受到了前所未有的重視。重組人睫神經(jīng)營養(yǎng)因子（recombinant human ciliary neurotrophic factor，rhCNTF）是第一個運用生物工程技術(shù)研發(fā)的蛋白多肽類減肥藥物。美國Regeneron公司開發(fā)的rhCNTF商品名稱為Axokine已于2001年獲FDA批準在美國進入Ⅲ期臨床試驗。

睫神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）是一種由200個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量為23000的生理活性物質(zhì)。CNTF最初曾用于治療肌側(cè)索硬化癥（ALS，一種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。1-4]，但臨床試驗中發(fā)現(xiàn)CNTF對ALS療效不明顯，卻意外發(fā)現(xiàn)患者的體質(zhì)量顯著降低，從而引起人們的關(guān)注，力圖將其開發(fā)成為一種新型的減肥藥物。本實驗根據(jù)衛(wèi)生部1993年頒布的新藥開發(fā)指導(dǎo)原則，旨在通過動物實驗來查明rhCNTF的減肥作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

①藥物：a.供試藥物：rhCNTF粉針劑，規(guī)格：2毫克/支，純度：98.6%，臨用前以滅菌注射用水2 mL溶解，并用生理鹽水稀釋至所需濃度。b.陽性對照藥：鹽酸西布曲明粉劑，純度：99.7%，臨用前以0.5%CMC配制成濃度為0.16%的混懸液。②受試動物：剛斷乳的SD大鼠，體質(zhì)量為（77.28±6.91）g。

1.2 方法

①肥胖大鼠模型的建立：取剛斷乳SD大鼠60只，雌雄兼用，隨機分成2組：第1組為正常對照組，20只大鼠，雌雄各半，投以普通飼料；第2組為造模組，100只大鼠，雌雄各半，投以營養(yǎng)飼料。各鼠分籠飼養(yǎng)，兩組大鼠每天每只投以等量飼料，第1、2周內(nèi)每天每只大鼠13 g，以后每周增加2 g。造模組動物平均體質(zhì)量超過正常對照組平均體質(zhì)量50%定為肥胖模型建立。②分組與給藥：肥胖模型建立后，先將大鼠隨機分成A、B兩大組，雌雄各半，A組為短期（10 d）給藥組，B組為長期（33 d）給藥組。A、B組各包括正常動物10只，肥胖動物50只，將A、B兩組動物再分別分成6組，每組10只，雌雄各半，分別為：a.正常對照組：自頸背部sc稀釋液1.0 mL/（kg·d）（正常大鼠）；b.肥胖對照組：自頸背部sc稀釋液1.0 mL/（kg·d）（肥胖大鼠）；c.高、中、低劑量組：自頸背部分別給sc rhCNTF 300 μg/（kg·d）（300 μg/mL ×1 mL/（kg·d））（肥胖大鼠）、sc rhCNTF100 μg/（kg·d）、100 μg/mL ×1 mL/（kg·d）、30 μg/（kg·d）、30 μg/mL×1 mL/（kg·d）；d.陽性藥對照組：灌胃（ig）鹽酸西布曲明8 mg/（kg·d）、1.6 mg/mL×5 mL/（kg·d）（肥胖大鼠）。③實驗測定指標：肥胖大鼠模型建立期間，每天早10：00稱取動物剩余食物量、投食量及撒食量，以計算動物攝食量。每周末早9：00稱取動物體質(zhì)量1次，與正常對照組比較，以監(jiān)測肥胖模型組體質(zhì)量的增重情況。動物飼養(yǎng)條件為溫度：（21±1） ℃，相對濕度為45%～55%。肥胖模型建立后，分組給藥，每天早9：00稱取動物體質(zhì)量，然后按體質(zhì)量給藥。每天早10：00稱取動物的剩余食物量、投食量及撒食量以計算攝食量。末次給藥后12 h，動物禁食過夜，次日用12%的水合氯醛2.5 mL/kg腹腔麻醉，測其體長（從鼻尖到肛門的長度），體質(zhì)量，按公式計算Lee's指數(shù)；腹主動脈取血、離心3000 r/min×10 min得血清，然后按試劑盒說明測定血糖（Glu）及血脂[包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）]含量。取腎周、腹股溝周圍及腹腔脂肪，稱取濕重；取生殖器周圍同一部位脂肪組織一小塊，經(jīng)2.5%的甲醛乙醇溶液固定后，包埋、石蠟切片、染色，在400倍顯微鏡下計數(shù)全視野脂肪細胞個數(shù)，并用測微器測量脂肪細胞大??；取一小段空腸，置于2.5%戊二醛中固定，并制成標本，用電鏡掃描觀察空腸絨毛長短粗細，比較各組間空腸絨毛密度和相對吸收面積。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS10.0軟件中的方差分析

2 結(jié) 果

2.1 營養(yǎng)性肥胖模型的建立

造模組大鼠給予營養(yǎng)飼料后體質(zhì)量增速明顯超過正常對照組，到第6周為止，正常對照組體質(zhì)量增加106 g（137.7%），而造模組體質(zhì)量增加205 g（267.7%）。造模組體質(zhì)量為正常對照組的154%。兩組間比較差異顯著（P＜0.01），說明肥胖模型建立。

2.2 rhCNTF對營養(yǎng)性肥胖大鼠的減肥作用

①應(yīng)用rhCNTF對肥胖大鼠體質(zhì)量的影響：rhCNTF的減肥作用十分迅速，皮下注射第1天即出現(xiàn)體質(zhì)量明顯下降，說明給藥后24 h即起效，每日給藥后高、中劑量組持續(xù)出現(xiàn)負增長，到第8天作用最為明顯，以后體質(zhì)量負增長逐漸減少。②rhCNTF對營養(yǎng)性肥胖大鼠Lee's指數(shù)和脂肪系數(shù)的影響：肥胖對照組脂肪系數(shù)（3.63±0.96）及Lee's指數(shù)（298.33±5.82）與正常對照組（1.75±1.20和284.29± 8.94）比較均明顯增加（P＜0.01）。與肥胖對照組比較，高、中劑量組的Lee's指數(shù)和脂肪系數(shù)明顯降低（P＜0.01），低劑量組對這兩項指標則無明顯影響（P＞0.05）。陽性對照藥（鹽酸西布曲明）對肥胖大鼠的Lee's指數(shù)未顯示出明顯影響（P＞0.05）。③rhCNTF對營養(yǎng)性肥胖大鼠血脂、血糖的影響：肥胖大鼠較正常大鼠TC、TG及血糖水平明顯升高，HDL-C明顯降低。與肥胖對照組比較，高、中劑量組可使TG、TC及血糖下降至正?；蚪咏Ｋ剑⒍加猩逪DL-C的作用。但低劑量組未顯示出此種降低TC、TG、血糖及升高HDL-C的作用。陽性對照藥有降低TC、TG和血糖作用，但對HDL-C未顯示升高作用。

2.3 rhCNTF對營養(yǎng)性肥胖大鼠脂肪細胞大小的影響

400倍光鏡下每視野的脂肪細胞數(shù)目在肥胖對照組明顯少于正常組對照；在高、中劑量組分別為（43.00±9.38）/視野和（43.30± 8.04）/視野，與肥胖對照組（30.90±4.07/視野）比較明顯增加（P＜0.01），亦即表明高、中劑量的rhCNTF能夠使脂肪細胞減小。而低劑量幾乎沒有這種作用（P＞0.05）。陽性對照藥西布曲明在短期應(yīng)用中對脂肪細胞的大小也顯示出明顯影響。

2.4 rhCNTF對營養(yǎng)性肥胖大鼠空腸絨毛密度和相對吸收面積的影響

肥胖對照組空腸絨毛的密度及相對吸收面積均顯著大于正常對照組（P＜0.01）。短期皮下注射rhCNTF后，營養(yǎng)性肥胖大鼠空腸絨毛密度及相對吸收面積與肥胖對照組比較未發(fā)生明顯改變（P＞0.05）。這說明在短期內(nèi)，rhCNTF對營養(yǎng)性肥胖大鼠空腸絨毛密度和相對吸收面積沒有發(fā)生顯著影響。

3 討 論

3.1 本研究表明rhCNTF具有強大的減肥作用。表現(xiàn)為體質(zhì)量、Lee's指數(shù)、脂肪系數(shù)以及TC和TG含量降低，HDL-C升高、脂肪細胞變小。以上各項指標的變化呈明顯的量效關(guān)系。中劑量100 μg/（kg·d）和高劑量300 μg/（kg·d）給藥后與肥胖對照組比較，上述指標均顯示明顯差異（P＜0.05或P＜0.01）。低劑量組30 μg/（kg·d）給藥后體質(zhì)量及其他有關(guān)指標與肥胖對照組比較均無明顯差異（P＞0.05）。

3.2 該研究中劑量的選擇主要依據(jù)參考文獻[5～7]，并通過預(yù)試驗確定。文獻[6]報道大鼠ip CNTF 250 μg/（kg·d）×4 d產(chǎn)生了了顯著的減肥作用。文獻[5]報道ob/ob小鼠飼喂營養(yǎng)飲食誘發(fā)肥胖后，皮下注射CNTF 0.03、0.1及0.3 mg/（kg·d）×7 d，產(chǎn)生了明顯的劑量依賴性減肥作用。文獻7報道ob/ob小鼠ip rhCNTF（2～50 μg/鼠/d×25 d）[7]，產(chǎn)生了進行性劑量依賴性體質(zhì)量下降，以及進食量的快速減少。我們在預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，大鼠皮下注射受試rhCNTF 30、100及300 μg/（kg·d）后數(shù)天即產(chǎn)生了劑量依賴性減肥作用。

3.3 本研究發(fā)現(xiàn)sc rhCNTF后，大鼠的進食量迅即進行性減少，至d4，進食量降至最低值，然后又逐漸回升，至d13基本達到給藥前進食量水平，并維持這一穩(wěn)定水平直至實驗結(jié)束。而大鼠體質(zhì)量的下降在第8天達到最低值，由此看出大鼠體質(zhì)量的降低遲后于進食量的時程變化。大鼠ig陽性對照藥西布曲明亦使進食量減少，與文獻報道一致[7-9]。

3.4 本研究中rhCNTF使進食量降低似乎證明該藥的減肥作用與其抑制食欲有關(guān)，這與國外文獻報道一致[5，6，10]。

3.5 本研究發(fā)現(xiàn)在長期應(yīng)用rhCNTF后，大鼠的空腸絨毛的相對吸收面積變小，這將影響營養(yǎng)物質(zhì)在腸道的吸收，這可能是長期應(yīng)用rhCNTF后大鼠進食量雖然已經(jīng)恢復(fù)但依然表現(xiàn)為減肥效果的主要原因。

4 結(jié) 論

①受試rhCNTF對營養(yǎng)性肥胖大鼠具有明確的減肥作用，表現(xiàn)為體質(zhì)量、Lee's指數(shù)、脂肪系數(shù)、血脂降低、脂肪細胞變小，空腸絨毛密度變小。其減肥作用呈明顯的劑量依賴關(guān)系。②受試rhCNTF的減肥作用強，起效迅速。③受試rhCNTF具有減肥降脂作用，表現(xiàn)為TC、TG含量降低，而HDL-C含量升高。④受試rhCNTF減肥的同時具有明顯的降糖作用。⑤受試rhCNTF的減肥作用可能與抑制食欲有關(guān)而長期應(yīng)用rhCNTF表現(xiàn)的減肥作用很可能與該藥降低絨毛密度從而影響營養(yǎng)物質(zhì)自小腸的吸收有關(guān)。

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R589.1

B

1671-8194（2014）27-0067-02