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    葛根通脈飲誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

    2014-01-25 16:40:21芳郜新蓮沈曉君趙君玫
    中國(guó)醫(yī)藥指南 2014年24期
    關(guān)鍵詞:通脈葛根素葛根

    陳 芳郜新蓮* 沈曉君趙君玫

    (1 河南省人民醫(yī)院,河南 鄭州 450003;2 河南中醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450008)

    葛根通脈飲誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

    陳 芳1郜新蓮2* 沈曉君2趙君玫2

    (1 河南省人民醫(yī)院,河南 鄭州 450003;2 河南中醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450008)

    目的研究葛根通脈飲對(duì)同型半胱氨酸(homocysteinemia,HCY)誘導(dǎo)增殖大鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的促凋亡作用。方法制備葛根通脈飲含藥血清,大鼠VSMC原代培養(yǎng)、鑒定,分為空白組、HCY組、葛根通脈飲組、瑞舒伐他?。啥ǎ┙M、葛根通脈飲聯(lián)合可定組。藥物干預(yù)后,Annexin/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果與空白組比較,HCY組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01);與HCY組比較,葛根通脈飲組、可定組、葛根通脈飲聯(lián)合可定組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論葛根通脈飲可促進(jìn)HCY誘導(dǎo)增殖的大鼠VSMC凋亡,可能是其抗動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)作用機(jī)制之一。

    葛根通脈飲;同型半胱氨酸;血管平滑肌細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

    血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)過(guò)度增殖是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)形成的主要病理機(jī)制之一,抑制VSMC增殖是防止AS病變發(fā)生發(fā)展、減輕血管重構(gòu)的的關(guān)鍵[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察我院的院內(nèi)制劑葛根通脈飲對(duì)同型半胱氨酸(homocysteinemia,HCY)誘導(dǎo)增殖大鼠VSMC的促凋亡作用,探討其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制,為葛根通脈飲臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 葛根通脈飲和瑞舒伐他?。啥ǎ┖幯逯苽?/p>

    葛根通脈飲由葛根30 g、山楂15 g、太子參12 g、當(dāng)歸尾6 g、淫羊藿6 g、赤芍6 g、川芎6 g、甘草6 g等組成,藥材購(gòu)自河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房并由制劑室制備成中藥湯劑。瑞舒伐他?。啥ǎ?,阿斯利康制藥有限公司,國(guó)A2002002。新西蘭大白兔給藥劑量為臨床用藥劑量的5倍,每日劑量分2次灌胃,連續(xù)5 d,末次給藥后1 h,腹主動(dòng)脈取血,離心、分離備用。

    1.1.2 主要儀器與試劑

    CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司);FACS Calibur 流式細(xì)胞儀(BD.USA公司產(chǎn)品);FLUOVIEW FV100共聚焦熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司);DMEM、胰蛋白酶(Gibco BRL. USA產(chǎn)品);Ⅱ型膠原酶 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA);α-SMA抗體(武漢博士德公司產(chǎn)品);Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司產(chǎn)品)。

    1.2 方法

    1.2.1 大鼠VSMC原代培養(yǎng)

    雄性wistar大鼠,體質(zhì)量200~250 g,購(gòu)自湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。戊巴比妥鈉腹腔麻醉后迅速分離、取出腹主動(dòng)脈,小心剝除血管外膜,縱行剪開(kāi)血管。PBS洗兩次,剪成0.5~2 mm大小的組織塊,放入含有1 mg/mLⅡ型膠原酶溶液的離心管中,37 ℃溫箱中消化30 min。劇烈震蕩離心管,除去內(nèi)皮細(xì)胞,將取出的組織塊放入1 mg/mL II型膠原酶溶液中,37 ℃溫箱中消化4~6 h,待組織塊呈絮狀后終止消化。離心,去上清,重懸細(xì)胞,轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞長(zhǎng)至75%匯合度時(shí),消化傳代,取2~5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 原代培養(yǎng)的大鼠VSMC免疫組織化學(xué)檢測(cè)

    細(xì)胞接種到6孔板中,培養(yǎng)72 h,去上清,PBS洗3次,4%多聚甲醛固定15 min,加入0.3%TritonX-100,倒掉后再加入TritonX-100室溫透化15 min,滴加30 μL血清封閉液(二抗宿主來(lái)源),室溫封閉30 min。加入一抗α-SMA抗體(1∶50),4 ℃孵育過(guò)夜。加入FITC標(biāo)記羊抗小鼠二抗(1∶100),37 ℃孵育30 min,同時(shí)加4’,6二脒基-2-苯吲哚鹽酸(4’,6-diamino-2-phenylindole,DAPI)染細(xì)胞核,37 ℃孵育30 min,封片后熒光顯微鏡下觀察。

    1.2.3 細(xì)胞分組與藥物干預(yù)

    取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞胰酶消化,制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。將處理好的蓋玻片放入6孔板各孔中,每孔準(zhǔn)確接種900 μL細(xì)胞懸液,繼續(xù)培養(yǎng)后將細(xì)胞分為空白組、HCY組、葛根通脈飲組、瑞舒伐他?。啥ǎ┙M、葛根通脈飲聯(lián)合可定組。除空白組外,各組均加入劑量為10-4mol/L同型半胱氨酸,培養(yǎng)24 h后,葛根通脈飲組加入葛根通脈飲含藥血清,可定組加入可定含藥血清,葛根通脈飲聯(lián)合可定組同時(shí)加入葛根通脈飲、可定含藥血清,培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞。

    1.2.4 Annexin V-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

    各組細(xì)胞用PBS洗滌,0.125%胰蛋白酶消化,轉(zhuǎn)移至離心管,加培養(yǎng)液,混勻,1000 r/min離心,棄上清,加PBS,重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL,取0.5 mL細(xì)胞懸液,1000 r/min離心4 min,棄上清,加0.5 mL Binding Buffer,重懸細(xì)胞,加1 μL熒光標(biāo)記的annexin V試劑,混勻,室溫下避光孵育20 min,加入PI 5 μL,混勻后4 ℃下避光孵育5 min,加入Binding Buffer 500 μL,隨即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率,用Flow max 2.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

    1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    各組細(xì)胞測(cè)定值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示,使用SPSS10. 0軟件包進(jìn)行單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法。

    2 結(jié) 果

    2.1 原代培養(yǎng)的大鼠VSMC形態(tài)及免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

    倒置相差顯微鏡觀察,培養(yǎng)的細(xì)胞多數(shù)呈長(zhǎng)梭形,核大,細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色,可見(jiàn)明顯的肌絲纖維。免疫組化結(jié)果顯示,細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)特異性標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)呈陽(yáng)性者超過(guò)98%的,提示培養(yǎng)細(xì)胞為VSMC。

    2.2 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

    與空白組(4.36±0.25)比較,HCY組(1.17±0.15)細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01),提示HCY可誘導(dǎo)VSMC增殖;葛根通脈飲、可定均可顯著促進(jìn)VSMC凋亡,葛根通脈飲組(3.08±0.14)、可定組(2.35 ±0.24)、葛根通脈飲聯(lián)合可定組(3.23±0.22)大鼠VSMC凋亡百分率與HCY組相比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

    3 討 論

    AS及其所致的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中是目前世界范圍內(nèi)兩大主要死亡原因[2]。研究證實(shí),AS的主要病理形態(tài)學(xué)特征之一是VSMC向動(dòng)脈內(nèi)膜的遷移和增殖。脂質(zhì)代謝紊亂、高HCY血癥等AS危險(xiǎn)因素可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,引起血小板和單核巨噬細(xì)胞黏附、聚集,血小板釋放的細(xì)胞因子促使VSMC遷移至血管內(nèi)膜,在內(nèi)膜增殖后,VSMC和巨噬細(xì)胞荷脂形成泡沫細(xì)胞,VSMC還可合成膠原纖維等基質(zhì),進(jìn)而形成AS斑塊,因此,抑制VSMC遷移和增殖,對(duì)于延緩或阻止AS病變發(fā)生發(fā)展及心血管病防治具有重大意義[3]。

    我們的前期研究發(fā)現(xiàn)[4-6],作為單體的葛根素具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,調(diào)節(jié)血脂水平,抑制VSMC增殖等良好的抗AS作用,葛根素預(yù)防性給藥能明顯抑制兔主動(dòng)脈AS病變,其機(jī)制與調(diào)控細(xì)胞周期、影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平、抑制AS過(guò)程中炎性反應(yīng)等密切相關(guān)。在前期工作的基礎(chǔ)上,根據(jù)臨證經(jīng)驗(yàn),我們以葛根為主藥,將葛根通脈飲方劑應(yīng)用于臨床,治療AS及其所致心腦血管疾病。方中葛根升陽(yáng)解痙,通利血脈為君;赤芍、川芎行血活血,山楂活血散瘀、化痰行氣,共助葛根散瘀通脈為臣;淫羊藿、太子參升提脾腎之陽(yáng)氣,當(dāng)歸補(bǔ)血養(yǎng)血,三藥同用,達(dá)氣帥血行,通而不滯之功,為佐藥;炙甘草補(bǔ)中益氣,固護(hù)脾胃,調(diào)和諸藥為使。本實(shí)驗(yàn)中,葛根通脈飲組和葛根通脈飲聯(lián)合可定組大鼠VSMC凋亡百分率顯著高于HCY組,提示葛根通脈飲可顯著促進(jìn)VSMC凋亡,可能是其抗AS作用機(jī)制之一。

    [1] Ghatak SB,Dhamecha PS,Bhadada SV,et al.Investigation of the potential effects of metformin on atherothrombotic risk factors in hyperlipidemic rats[J].Eur J Pharmacol,2011, 659(2/3):213-223.

    [2] Hansson GK,Hermansson A.The immune system in atherosclerosis[J].Nat Immunol,2011,12(3):204-212.

    [3] 李桂源.病理生理學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:341-350.

    [4] 沈曉君,魏群,陳芳,等.葛根素誘導(dǎo)血管平滑肌凋亡的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制研究[J].新中醫(yī),2011,43(2):139-141

    [5] 魏群,陳芳,沈曉君,等.葛根素對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化炎性因子的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2011,31(18):3541-3543.

    [6] 沈曉君,魏群,陳芳,等.葛根素對(duì)血管平滑肌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2011,17(1):69-70.

    R285.5

    B

    1671-8194(2014)24-0069-02

    河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13A310612)

    *通訊作者:E-mail:shenxiaojun0628@163.com

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