HPLC法測定核桃楸葉中槲皮素、山奈酚含量

謝 健 霍金海 王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院·150036）

核桃楸葉為胡桃科胡桃屬植物核桃楸（Julans Mandshurica Maxim.）的樹葉。原植物核桃楸為胡桃科胡桃屬落葉喬木，主要分布于中國東北、華北、河北等地區(qū)，其種子、青果，樹皮均可入藥[1-2]。

核桃楸葉作為核桃楸新的藥用部位，現(xiàn)代藥理學研究表明，其具有抗腫瘤[3]、抗氧化、抑菌[4]等活性，目前，學者已從核桃楸葉中分離出醌類、黃酮類、萜類、多酚類等多類型化合物，這些研究為核桃楸葉的開發(fā)提供了基礎，但目未見關于核桃楸葉的質量控制的方法。

核桃楸葉中含有豐富的黃酮類成分，其中槲皮素和山奈酚是其典型代表化合物，現(xiàn)代藥理學也表明槲皮素和山奈酚均具有抗腫瘤、抗氧化等活性[5]，因此槲皮素和山奈酚可以作為控制核桃秋葉質量標準的指標性成分。本文采用HPLC法測定核桃楸葉中上述兩種功效成分的含量，為核桃楸葉的開發(fā)提供研究數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010CHT型高效液相色譜儀（日本島津），BP211D型電子天平（Sartorius公司），DZG-303A超純水機（頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司），KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（100081-200406）；山奈酚對照品（110861-200406）均由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

核桃楸葉樣品分別采于黑龍江省伊春市、五常市、賓縣、方正、哈爾濱市，經黑龍江省中醫(yī)藥科學院初東君主任藥師鑒定為胡桃科胡桃屬植物核桃楸(Juglans mandshurica Maxim)的葉子，陰干后粉碎。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品的配制 精密稱取槲皮素，山奈酚對照品各2.53mg、3.71mg，置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為101.2μg·mL-1，148.4μg·mL-1溶液，0.45μmL濾膜過濾，得對照品溶液備用。

2.1.2 供試品的配制 取核桃楸葉約1.0g，精密稱定，加甲醇25mL，稱定重量，80℃回流1h，冷卻，甲醇補足失重，過濾，微孔濾膜（0.45μmL）濾過，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱DiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm)；流動相：甲醇-0.2%磷酸（57:43），流速1.0mL·min-1，檢測波長360nm，柱溫：35℃，進樣量10μL。

2.3 系統(tǒng)適應性試驗

精密吸取對照品溶液和供試品溶液，按2.2項下色譜條件，分別進樣10μL，記錄色譜圖，結果表明在此色譜條件下，槲皮素，山奈酚分離良好，分離度均＞1.5，且理論塔板數(shù)均不低于4000。

2.4 線性關系考察

精密吸取槲皮素，山奈酚對照品溶液2.5、5.0、10、20、25μL，測定峰面積，以峰面積為橫坐標，槲皮素、山奈酚量為縱坐標作標準曲線，測得回歸方程：槲皮素Y＝3423.3x＋5.2652（r=0.9998），山奈酚Y＝3313.1x＋5.9435(r=0.9999)。結果表明，槲皮素在0.253μg～2.53μg范圍內呈良好線性關系，山奈酚在0.371μg～3.71μg范圍內呈良好線性關系。

2.5 精密度考察

分別精密吸取槲皮素，山奈酚對照品溶液連續(xù)進樣5次，每次10μL，測定兩種對照品的峰面積。結果，槲皮素，山奈酚峰面積的RSD分別為0.71%，0.65%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

分別精密吸取同一供試品溶液10μL，在0，2，4，6，8，10，12，24h進樣，記錄供試品溶液中槲皮素，山奈酚的峰面積，計算各成分含量。樣品中槲皮素，山奈酚含量的RSD分別為1.26%，1.38%，表明樣品樣品溶液在24小時內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

按2.1.2項下供試品處理方法平行處理6份樣品，測定2種成分的峰面積，計算含量。結果樣品中槲皮素，山奈酚含量的RSD分別為1.06%，1.24%，表明該方法重復性良好。

2.8 回收率試驗

稱取已知含量的核桃楸葉粉末0.5g，共6份。分別精密加入與藥材相當量的槲皮素對照品（0.8 mg·mL-1）1mL，山奈酚對照品溶液(0.5 mg·mL-1）1mL，按2.1.2項下供試品制備方法制備，進樣10μL，計算各對照品的平均加樣回收率和RSD值，結果見表1、表2，測定槲皮素的平均回收率為98.62%、RSD值為1.45%；山奈酚平均回收率為99.02%、RSD值為1.11%。

表1 槲皮素加樣回收試驗結果

表2 山奈酚加樣回收試驗結果

2.9 樣品含量測定

取五個產地樣品，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，采用2.2項下色譜條件進行兩種成分的含量測定，結果見表3。

表3 五個產地核桃秋葉的槲皮素、山奈酚含量 （mg·g-1）

3 討論

3.1 波長的選擇

考察了250nm，265nm，280nm，360nm不同吸收波長的圖譜，發(fā)現(xiàn)在360nm處，其吸收值達到最大，圖譜特征性強，故以360nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

本實驗采用甲醇-0.2%磷酸體系來分離，考察甲醇-0.2%磷酸57:43，55:45，53:47，50:50，最后確立了以甲醇-0.2%磷酸（57:43）為流動相分離度最好，確定流速為1.0mL/min。

3.3 提取條件的選擇

在樣品制備過程中，以超聲和加熱回流提取作對比，結果發(fā)現(xiàn)加熱回流是超聲提取的含量的一倍，后者提取效果比較好，另考察了提取時間，結果以每次1小時為最佳，最后以甲醇80℃回流1h為最佳。

本文建立了高效液相同時檢測核桃秋葉中槲皮素和山奈酚的方法，簡便快捷，容易掌握，對核桃秋葉質量標準的研究起到了一定的作用。

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