響應(yīng)面分析法優(yōu)選番石榴果實(shí)中多糖的超聲提取工藝

孔繁晟，明建斌，黃志鵬，韓 灝，張培穎

（廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣州 510006）

響應(yīng)面分析法優(yōu)選番石榴果實(shí)中多糖的超聲提取工藝

孔繁晟＊，明建斌，黃志鵬，韓 灝，張培穎

（廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣州 510006）

目的：優(yōu)選超聲提取番石榴果實(shí)中多糖的工藝。方法：通過(guò)單因素試驗(yàn)考察超聲提取的時(shí)間、功率、溫度、液料比對(duì)超聲提取番石榴果實(shí)中多糖提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，以多糖提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法研究提取溫度、提取時(shí)間和提取功率及其交互作用對(duì)番石榴果實(shí)中多糖提取率的影響。結(jié)果：最佳超聲提取工藝為超聲溫度45℃、超聲功率280W、超聲時(shí)間30min。在此條件下，多糖平均提取率為2.28%。結(jié)論：所選工藝合理、可行，可用于番石榴果實(shí)中多糖的超聲提取。

番石榴；多糖；超聲輔助提??；響應(yīng)面分析法

番石榴為桃金娘科番石榴屬植物，是常綠小喬木或灌木。品種有臺(tái)灣新世紀(jì)、珍珠、水晶、胭脂紅、七月紅、柿蒂等十余種，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效。番石榴果味獨(dú)特、鮮美，富含有益于人體的各種營(yíng)養(yǎng)成分，既可鮮食、煮熟吃、釀酒，又可加工成果汁、果醬、罐頭等系列產(chǎn)品，還具有藥用和保健作用。國(guó)內(nèi)、外民間常用其治療糖尿病[1-2]，療效較好。我國(guó)民間用番石榴葉的水煎液治療腹瀉、止血、腸炎、嘔吐等疾病。

超聲輔助提取技術(shù)[3]由于具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)能、省時(shí)等特點(diǎn)被廣泛用于天然藥物的浸提。傳統(tǒng)的工藝設(shè)計(jì)方法，如正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)等，都有各自的局限性，不能全面地優(yōu)化工藝。響應(yīng)面分析法采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，該方法試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、求得的回歸方程精度高、能研究幾種因素間的交互作用，是一種具有突出優(yōu)勢(shì)的優(yōu)化試驗(yàn)條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法[4-7]。

本研究探討超聲輔助提取番石榴果實(shí)中多糖成分，通過(guò)響應(yīng)面法確定最優(yōu)提取工藝，旨在最大限度地提高番石榴這種藥食兩用資源的綜合利用性，為其進(jìn)一步的活性研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

KH-400KDB高功率超聲器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率：240W，頻率：40kHz）；HH-4恒溫水浴箱（金壇市宏華儀器廠）；TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；752紫外-可見分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3D pH計(jì)（上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司）。

1.2 藥材

番石榴，購(gòu)自廣東番禺長(zhǎng)洲水果市場(chǎng)，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院騰希峰博士鑒定為桃金娘科（Myrtaces）番石榴屬植物珍珠番石榴Psidium guajavaL.的果實(shí)。

1.3 試劑

d-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-200302，純度≥95%）；苯酚、濃硫酸、95%乙醇等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105℃下干燥至恒質(zhì)量的d-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品10.2mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 番石榴果實(shí)經(jīng)削皮、去核、烘干、打粉等處理，精密稱取粉末2.0g，經(jīng)蒸餾水超聲輔助提取，濾過(guò)，濾液濃縮至100ml，搖勻，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取對(duì)照品溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，置10ml量瓶中，蒸餾水定容，用移液管各取1.0ml于試管中，在冰水浴條件下緩慢加入5%苯酚溶液1.0ml，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0ml，混勻，沸水浴10min后冷卻至室溫。以1.0ml蒸餾水按同樣操作為空白，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度（A）。以A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為c＝10.8960A－0.0044（r＝0.9994）。結(jié)果表明，葡萄糖對(duì)照品的質(zhì)量濃度在20～60μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.4 多糖提取率的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，取2.0ml供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)得的A代入回歸方程計(jì)算多糖質(zhì)量濃度，再按下式計(jì)算多糖提取率：多糖提取率＝多糖提取質(zhì)量/番石榴果實(shí)樣品質(zhì)量×100%。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 固定提取時(shí)間為30min、超聲波功率為280W、液料比為25∶1（V/m）、去離子水pH為7，考察提取溫度分別為20、30、40、50、60℃時(shí)多糖提取率的變化。提取溫度對(duì)多糖提取率的影響見圖1。

圖1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig1 Effects of extract temperature on the extract rate of polysaccharide

由圖1可知，總體上，隨著溫度的升高，多糖提取率也逐步上升，當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，多糖提取率趨于穩(wěn)定，當(dāng)提取溫度達(dá)到60℃時(shí)，提取率最高。升高溫度有利于提取率的提高，一般來(lái)說(shuō)，溫度升高，溶劑的表面張力系數(shù)及黏滯系數(shù)下降，蒸氣壓升高，超聲空化閾值下降，有利于空化泡的產(chǎn)生；但是另一方面，由于蒸氣壓的增大，導(dǎo)致空化強(qiáng)度或空化效應(yīng)下降，從而不利于提取過(guò)程的強(qiáng)化。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 固定提取溫度為40℃、超聲功率為280W、液料比為25∶1（V/m）、去離子水pH為7，考察提取時(shí)間分別為20、25、30、35、40min時(shí)多糖提取率的變化。提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig2 Effects of extract time on the extract rate of polysaccharide

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率不斷增高，提取30min時(shí)達(dá)到最大值，30min后呈下降趨勢(shì)。作用時(shí)間在25～30min時(shí)，多糖的提取效果較好。由于番石榴多糖主要存在于細(xì)胞間和細(xì)胞壁中，超聲處理時(shí)間太短不足以破碎細(xì)胞，釋放多糖；時(shí)間太長(zhǎng)，則超聲波的機(jī)械剪切力對(duì)多糖有一定的降解和破壞作用；而且隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)升高水溫促使多糖的水解速度加快，增加雜質(zhì)含量，降低多糖含量。2.2.3提取功率對(duì)多糖提取率的影響 固定提取溫度為40℃、提取時(shí)間為30min、液料比為25∶1（V/m）、去離子水pH為7，考察提取功率分別為200、240、280、320、360W時(shí)多糖提取率的變化。提取功率對(duì)多糖提取率的影響見圖3。

圖3 提取功率對(duì)多糖提取率的影響Fig3 Effects of extract power on the extract rate of polysaccharide

由圖3可知，隨著提取功率的升高，多糖的提取率隨之增高，當(dāng)功率為280W時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最大值。對(duì)于一定頻率和一定發(fā)射面的超聲來(lái)說(shuō)，聲強(qiáng)隨著功率增大而增大。如果聲強(qiáng)增大，聲壓幅值以及液體中壓力亦增大，空化泡崩潰所需的時(shí)間將變得更短，也就是說(shuō)單位時(shí)間內(nèi)超聲產(chǎn)生的空化作用的次數(shù)增多，從而有利于植物藥有效成分提取率的提高。然而，當(dāng)提取功率超過(guò)280W時(shí)，多糖的提取率有所下降，因?yàn)楦吖β食暡梢援a(chǎn)生熱量，也可能對(duì)大分子的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而降低多糖提取率。

2.2.4 液料比對(duì)多糖提取率的影響 固定提取時(shí)間為30min、提取溫度為40℃、提取功率為280W、去離子水pH為7，考察液料比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（V/m）時(shí)多糖提取率的變化。液料比對(duì)多糖提取率的影響見圖4。

圖4 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig4 Effects of ratio of liquid to solid on the extract rate of polysaccharide

由圖4可知，當(dāng)液料比大于1∶25（V/m）時(shí)，提取率隨著液料比的增大而提高。但是，當(dāng)液料比小于1∶25（V/m）時(shí)，改變液料比對(duì)提取率的影響不大。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)選工藝

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，且為了節(jié)約物料和減少試驗(yàn)次數(shù)，固定多糖提取率最高時(shí)的液料比，即25∶1（V/m）。選定提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）、提取功率（X3）為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken的中心組合原理，對(duì)多糖提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析。因素與水平見表1；Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab1 Factors and levels

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Tab2 Box-Behnken design and results

2.3.2 試驗(yàn)分析 將表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，并通過(guò)SAS9.2軟件繪制各考察因素影響多糖提取率的三維效應(yīng)面和二維等高線圖?；貧w統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表3；三維效應(yīng)面和二維等高線圖見圖5。

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Tab3 Results of regression analysis

由表3可知，各考察因素對(duì)工藝的影響順序?yàn)樘崛囟龋咎崛r(shí)間＞提取功率，且所建模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001），因變量與所考察自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2＝0.9874）。模型的RAdj2＝0.9648，說(shuō)明該模型能解釋96.48%響應(yīng)值的變化，擬合度較好，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明本試驗(yàn)所得的二次回歸方程顯著度較高，能較好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)X1、X2、X3及二次項(xiàng)X12、X22、X32表現(xiàn)極顯著，說(shuō)明它們對(duì)響應(yīng)值的影響較大，且所考察因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的一次線性關(guān)系。

圖5 三維效應(yīng)面和二維等高線圖Fig5 Three-dimensional response surface and two-dimensional contour map

2.4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

取番石榴藥材適量，共3批，根據(jù)上述優(yōu)選的工藝進(jìn)行提取，并測(cè)定多糖提取率。結(jié)果，多糖提取率分別為2.25%、2.31%、2.28%，平均值為2.28%。而根據(jù)方程預(yù)測(cè)的多糖提取率與實(shí)際平均值僅相差0.02%，表明優(yōu)選的工藝合理、可行。

3 討論

超聲輔助提取技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便、節(jié)能、省時(shí)，近年來(lái)廣泛用于天然產(chǎn)物的浸提[8-9]。超聲提取技術(shù)是利用超聲空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、熱效應(yīng)等多重作用，在流體內(nèi)產(chǎn)生瞬間的高溫高壓場(chǎng)，對(duì)流體中的固體表面產(chǎn)生強(qiáng)大剪切力，同時(shí)有較大的攪動(dòng)作用，從而能促進(jìn)傳質(zhì)。已有的研究表明，超聲提取技術(shù)其提取效率是常規(guī)熱回流、浸漬法以及煎煮法的幾倍到幾十倍，單位物料的能耗較常規(guī)方法降低了50%以上，而且最大限度保留了中藥及天然藥物的有效成分，收率大幅度提高。但是，由本超聲輔助提取多糖的試驗(yàn)可看出，某些因素的水平并不是越大越好，如提取頻率、提取時(shí)間等。這可能是由于多糖是一類大分子和多分鏈接的結(jié)構(gòu)，在提取這樣結(jié)構(gòu)的物質(zhì)時(shí)，過(guò)大的能量和過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間會(huì)對(duì)大分子和多分鏈接的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生分解和破壞作用。因此，以超聲作為提取方法時(shí)，對(duì)提取因素和水平的優(yōu)化就顯得特別的重要。

[1] 杜楊吉，王三永，李春榮.番石榴葉多糖分離純化工藝研究[J].中國(guó)食品添加劑，2011（1）：156.

[2] 王波，劉衡川，洪君蓉，等.番石榴葉水提取物對(duì)糖尿病小鼠小腸α-葡萄糖苷酶活性的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2007，38（2）：298.

[3] 孔繁晟，賁永光，孫愛群，等.超聲法與連續(xù)回流法提取黃芪總黃酮的工藝對(duì)比研究[J].中國(guó)藥房，2010，21（19）：1752.

[4] Yifang Y，Jingqian F，Haiyan X，et al.Influence of different extraction and purification methods on Astragalus polysaccharides and pharmacological evaluation[J].Chinese Herbal Medicines，2010，2（1）：54.

[5] 田寶成，賈昌平，楊軍濤，等.Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化紅旱蓮總黃酮提取工藝的研究[J].中成藥，2010，32（3）：389.

[6] 賈亮亮，袁丁，何毓敏，等.多糖提取分離及含量測(cè)定的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（3）：189.

[7] Xia Q，Li HD，Hong L.Optimization of the ultrasonic assisted extraction of polysaccharides from Dendrobium huoshanense by response surface method[J].Medicinal Plant，2012，3（8）：78.

[8] 牛立新，李章念，李紅卷，等.超聲波提取卷丹鱗莖中總黃酮研究[J].中草藥，2007，30（1）：85．

[9] 張嘉，李多偉，王義潮，等.仙人掌中總黃酮超聲萃取工藝的研究[J].中成藥，2005，27（8）：968．

Optimization of Ultrasonic Extraction Technology of Polysaccharides from the Fruit ofPsidium guajavaby Response SurfaceAnalysis

KONG Fan-sheng，MING Jian-bin，HUANG Zhi-peng，HAN Hao，ZHANG Pei-ying
（College of Pharmaceutical Science，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To optimize ultrasonic extraction technology of polysaccharides from the fruit ofPsidium guajava.METHODS：Single factor experiment was adopted to investigate the effects of ultrasonic extract time，power，temperature and solid-liquid ratio on the extract rate of polysaccharide from the fruit ofP.guajava.On this basis，by Box-Behnken center composite design，with the extract rate of polysaccharide the fruit ofP.guajavaas the response value，response surface analysis method was adopted to research the effects of extract temperature，extract time，extract rate and interaction on the extract rate of polysaccharide from the fruit ofP.guajava.RESULTS：The optimal ultrasonic extraction technology was as follows：ultrasonic temperature of 45℃，ultrasonic power of 280W，ultrasonic time of 30min.Under thr above conditions，the average extraction rate of polysaccharide was 2.28%.CONCLUSIONS：The technology is reasonable and feasible，and can be used for the ultrasonic extraction of polysaccharide from the fruit ofP.guajava.

Psidium guajava；Polysaccharides；Ultrasonic assisted extraction；Response surface analysis

R284.2；R283

A

1001-0408（2014）15-1382-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2014.15.13

＊高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主管藥師。研究方向：天然藥物制劑、制藥工程。電話：020-39352118。E-mail：kmkfs@163.com

2013-05-28

2013-09-13）